胡椒單萜類化合物對單增李斯特菌抑菌機理的研究

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(海南大學食品學院,海南海口 570228)

目前在食品保鮮方面,市場上占主導地位的是化學抑菌劑,但隨著醫學、毒理學和生物學研究的不斷深入,發現大多化學抑菌劑對人體都有不同程度的傷害。與之相比,天然抑菌劑的毒性遠遠低于化學保鮮劑的毒性,且抑菌效果顯著。胡椒是我國衛生部第一批公布的藥食兼用的植物材料之一,屬于多年生常綠大型藤本植物[1]。胡椒中揮發油含量4.5%以上,所含成分大多為胡椒單萜類化合物(如檸檬烯等),可抑制微生物生長,此外,胡椒堿和胡椒脂堿是構成胡椒辛辣風味的植物堿[2]。

胡椒揮發油對動物和植物病菌、腐敗菌均有抑制效果,椒醇提取物對常見食品污染菌有較強的抑制作用[3]。Pradhan等[4]研究了青胡椒提取物的抑菌作用,發現該物質對鼠傷沙門氏菌、葡萄球菌和大腸桿菌均有抑制作用。目前,大多研究僅討論了天然抑菌劑的宏觀抑菌特性,但具體到胡椒中何種成分起作用以及對細菌的作用靶點卻鮮有報道。

蛋白質組學是研究和探索蛋白質組的一門新興學科,是功能基因組學的重要組成部分。同位素標記相對和絕對定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)作為一種現代的蛋白組學技術,幾乎可以對任何蛋白樣品進行定量分析,具有高定量精度的特點,目前已廣泛應用于定量蛋白質組學領域[5]。本文基于蛋白組學技術,研究胡椒單萜類化合物對單增李斯特菌(L.monocytogenes)的抑菌機制,通過分析單增李斯特菌的差異蛋白、呼吸鏈復合體以及三磷酸腺苷酶(ATP酶)等指標,根據同源建模與分子對接技術探索其作用靶點,為進一步明確胡椒單萜類化合物的抑菌機制提供基礎和依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

成熟胡椒果 海南省文昌市;L.monocytogenes中國科學院微生物研究所;胰酪胨大豆肉湯培養基(TSB)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、碘乙酰胺(IAM)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二硫蘇糖醇(DTT)、胰蛋白酶(Trypsin,potency≥2500 units/mg)和牛血清蛋白(純度≥98%) 海南海道森科技有限公司;BCA蛋白定量試劑盒、質譜級胰蛋白酶、iTRAQ 4-plex標記試劑盒、低分子量預覽蛋白質Marker 美國Sigma公司。

TP-313電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯萃取頭 美國Supelco;Vaco2-Ⅱ冷凍干燥系統 德國ZIRBUS;B-220旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠;超聲波細胞破碎儀 美國SONICS;GC-6890氣相色譜儀 滕州市滕海分析儀器有限公司;強陽離子交換色譜柱(SCX) 上海楚定分析儀器有限公司;Triple TOF5600液相串聯質譜(LC-MS/MS) 美國Applied Biosystem。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品預處理 將采集的成熟胡椒果500 g置于陽光下暴曬3～4 d,液氮粉碎(2800 r/min)后冷凍(-40 ℃)干燥38 h,保鮮袋密封,4 ℃條件下保存備用。

1.2.2 胡椒單萜類化合物的提取 參考王延輝等[6]的方法,采用蒸餾萃取提取(SDE)的方法,提取胡椒中的單萜類化合物。SDE條件:取50 g胡椒粉末置于500 mL的圓底燒瓶中,加入200 mL超純水和少量玻璃珠。接收端裝90 mL沸程90～120 ℃石油醚,85 ℃恒溫水浴提取60 min。萃取后上層有機相過50 g無水硫酸鈉柱,濾液經旋轉蒸發儀濃縮后便制得胡椒單萜類化合物。

1.2.3 菌種活化 吸取5 μL保存于-80 ℃凍存的L.monocytogenes凍存液,接種到裝有5 mL滅菌TSB肉湯培養基中。用試管塞塞好試管,并用報紙包好試管管口,將試管傾斜放置于37 ℃恒溫振蕩培養箱中,將恒溫振蕩器速度調節至80 r/min,振蕩培養16 h后,在TSB肉湯培養基中傳代三次,之后采取平板劃線法純化菌種,接種環接種于瓊脂板上并倒扣。將平板倒放在37 ℃恒溫培養箱中培養16～24 h后,挑取單個菌落,在無菌條件下接種到TSB肉湯培養基的試管中,按照上述所說的方法再一次培養12 h。用滅菌過的TSB肉湯培養基將菌液進行稀釋,使溶液在600 nm波長處的吸光值為0.1,此時菌液中的菌落個數為5×108cfu/mL,菌液置于4 ℃保存備用。

1.2.4L.monocytogenes生長曲線的測定 參考Qiu等[7]的方法,取40 mL菌液移入EP管中,實驗組(SA)加入0.3 g胡椒單萜類化合物,同時設立空白對照組(CK)。EP管置于37 ℃的恒溫振蕩搖床中培養,在24 h內每隔4 h移出10 μL菌液,滴在瓊脂培養基上測定L.monocytogenes菌落數。

1.2.5 胡椒單萜類化合物對Na+-K+-ATPase及Ca2+-ATPase活力的影響 參考陸海霞等[8]方法,將CK組與SA組用無菌生理鹽水制備成106～107cfu/mL的菌懸液,經超聲(25 W,10 min)破碎。采用超微量Na+-K+-ATPase和Ca2+-ATPase試劑盒測定Na+-K+-ATPase和Ca2+-ATPase活性。菌懸液在24 h內每隔4 h測定一次酶活力,酶活力單位定義為每小時每毫克組織蛋白的組織中ATP酶分解ATP產生1 μmol無機磷的量,單位U/mg。

1.2.6 iTRAQ法定量蛋白質 取50 mL菌液移入EP管中,SA加入0.3 g胡椒單萜類化合物,同時設立CK,4 ℃下冷藏。將SA與CK用無菌生理鹽水制備成106～107cfu/mL的菌懸液,進行超聲(25 W,10 min)破碎。參考周業豐[6]的方法提取菌液中的蛋白,并對蛋白樣品依次進行還原烷基化處理、Trypsin酶解、iTRAQ 4-plex標記肽段、標記后的肽段混合、SCX進行預分離、LC-MS/MS分析采集數據。用數據庫(27029sequences)對蛋白質序列進行鑒定,Mascot進行數據庫搜索,依據蛋白質豐度水平,當差異倍數大于1.2 倍,且經統計檢驗其P-value值小于0.05時,視為SA與CK之間的表達上調或下調差異蛋白。

1.2.7 呼吸鏈復合體活性的測定 取50 mL菌液移入EP管中,SA加入0.3 g胡椒單萜類化合物,同時設立CK,4 ℃下冷藏。在冷藏的第8 h取出菌液,將菌液在低壓緩沖液中水浴與冰箱中反復凍融3次(凍5 h、溶1 h),使得呼吸鏈復合體能夠盡可能釋放。參考Allen等[9]的方法測定呼吸鏈復合體(MRCCⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ)的活性。

1.2.8 同源模建與分子對接 選取蛋白組學中與呼吸鏈相關的蛋白作為受體,胡椒單萜類化合物作為配體。使用Swiss-Model軟件,提交蛋白的序列數據,然后對每一條氨基酸序列在數據庫中尋找各自的序列同源性較高的同源蛋白,使用這些已知晶體結構的蛋白質作為模板。根據模板蛋白序列質量、與目標蛋白的序列相似性以及序列覆蓋度等指標,選擇同源性最好的三種蛋白質結構作為目標蛋白的模板,構建其三維結構模型。分子對接過程中,在找到受體和與之結合的配體的三維結構模型的基礎上,通過計算尋找到靶標分子的活性結合位點,并將配體放置在活性結合位點處。通過不斷優化配體分子的構象與結合方式,模擬受體與配體分子結合的過程,預測其可能的結合方式,通過打分函數從結果中篩選出與受體結合后最接近天然結合構象的配體[10]。

1.2.9 統計分析 每組試驗做3次重復實驗。方差分析:SPSS 19.0軟件對數據進行T檢驗;圖形制作:Origin 8.0。;數據庫:27029sequences;蛋白質鑒定軟件:Mascot搜索。

2 結果與分析

2.1 添加胡椒單萜類化合物對單增李斯特菌落數的影響

圖1為添加濃度30 mg/mL胡椒單萜類化合物后0～24 h內L.monocytogene的生長曲線,由圖1可知,CKL.monocytogene菌落數不斷增加,SAL.monocytogenes菌落數呈先增后減的趨勢。在培養4～16 hL.monocytogene菌落數顯著降低(p<0.05),8～24 h SA中L.monocytogene菌落數顯著低于CK(p<0.05)。胡椒提取物對來自于口腔中的細菌菌株具有較強的抑制作用,20 mg/mL的胡椒石油醚相提取物對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌等抑菌效果良好[11-12]。

圖1 L. monocytogenes生長曲線Fig.1 L. monocytogenes growth curve

2.2 添加胡椒單萜類化合物對L. monocytogenes ATP酶活力的影響

ATP酶是一類能將三磷酸腺苷(ATP)催化水解為二磷酸腺苷(ADP)和磷酸根離子的酶,其中Na+-K+-ATPase是鑲嵌在細胞膜磷脂雙分子層中的一種蛋白質,可將細胞內的Na+釋放到胞外同時將胞外的K+運輸入細胞,Ca2+-ATPase對維持細胞正常生命活動至關重要[13]。由圖2可知,在24 h內,SA中Na+-K+-ATPase和Ca2+-ATPase活力呈先上升后下降的變化趨勢,CK酶活力相對穩定。添加胡椒單萜類化合物后L.monocytogenes的Na+-K+-ATPase和Ca2+-ATPase活力在0～4 h均顯著升高(p<0.05),在4～24 h顯著下降(p<0.05),16～24 h SA顯著低于CK組(p<0.05),Na+-K+-ATPase活力迅速下降可使細胞膜內外形成H+梯度差,H+梯度差會改變細胞膜的通透性[14]。添加胡椒單萜類化合物后可能破壞了L.monocytogenes的細胞膜,使細胞膜的通透性增加,改變細胞膜的流動性,從而影響Na+-K+-ATPase和Ca2+-ATPase的活性[15]。Na+-K+-ATPase和Ca2+-ATPase活力降低導致細胞內多肽和蛋白質不能正常合成和分解,酶活力的變化會進一步改變膜的通透性,從而加快細胞凋亡[16-18]。

圖2 單核增生李斯特菌Na+-K+-ATPase和Ca2+-ATPase活力隨時間的變化Fig.2 Changes of the cctivities of Na+-K+-ATPase and Ca2+-ATPase in L. monocytogenes with time

2.3 胡椒單萜類化合物對單核增生李斯特菌的蛋白組變化研究

在質譜圖中,任何一種iTRAQ試劑標記的不同樣本中的同一蛋白質表現為相同的質荷比。在串聯質譜中,根據波峰的高度及面積,可以得到蛋白質的定量信息,尋找差異表達蛋白,分析蛋白功能。本研究對CK 0 h,SA 0 h,CK 8 h,SA 8 h,SA 24 h,CK 24 h六組數據兩兩進行比較,篩選出1.2倍以上的差異蛋白[5]。

由圖3可知,差異蛋白最多的是SA 24 h/CK 24 h,最少的是SA 0 h/CK 0 h,所以添加胡椒單萜類化合物后,L.monocytogene中差異蛋白數量與處理時間成正比。SA 24 h/CK 24 h中上調蛋白數量顯著高于高于下調蛋白(p<0.05),L.monocytogene生理狀態可能受到胡椒單萜類化合物的影響,上調蛋白數量占多數,有著更多的生物學進程被激活。實驗組 SA 0 h,SA 8 h,SA 24 h 三者之間進行互相比較,同樣也產生了差異蛋白,但相比 SA 8 h/CK 8 h和SA 24 h/CK 24 h差異蛋白的數量顯著降低(p<0.05),差異蛋白中上調蛋白和下調蛋白數目接近,這些差異蛋白應該是L.monocytogenes正常生長過程中的蛋白變化[8]。

圖3 胡椒單萜類化合物處理組差異蛋白統計Fig.3 Statistics of differential protein in the treatment group of pepper monoterpenoids注:圖中不同字母表示差異顯著(p<0.05)。

2.4 胡椒單萜類化合物對L. monocytogenes呼吸鏈復合體Ⅰ-Ⅴ的影響

由表1可知,L.monocytogene呼吸鏈復合體I～V活力均呈下降趨勢,在8～24 h添加胡椒單萜類化合物后呼吸鏈復合體I和V活力顯著低于對照組(p<0.05)。呼吸鏈可為細胞提供維持正常生命活動所需的ATP,L.monocytogene的呼吸鏈位于質膜上。胡椒單萜類化合物可能通過抑制L.monocytogene呼吸鏈復合體活性減弱呼吸作用,阻斷電子從NADH到輔酶Q的傳遞,導致維持L.monocytogene正常生命活動的ATP和蛋白質不能及時合成,從而導致菌體衰亡。結合差異蛋白的統計結果來看,胡椒單萜類化合物可能抑制酶復合物蛋白的形成,從而引發酶復合物蛋白表達量的巨大變化。

表1 單核增生李斯特菌呼吸鏈復合體Ⅰ-Ⅴ活力隨時間的變化Table 1 Changes of Ⅰ-Ⅴ activity of LM respiratory chain complex with time

呼吸電子傳遞鏈是能量代謝過程中重要的組成部分,任何一個復合體活性受到抑制都將導致生物體不能正常地合成ATP,進而衰竭死亡[19]。

2.5 胡椒單萜類化合物與L. monocytogene呼吸鏈蛋白同源模建

同源模建方法是基于序列的同源性決定了三維結構的同源性的原理,是目前預測蛋白質三級結構常用的方法。如果兩個蛋白質三維結構的保守性比氨基酸序列的保守性高,則兩個蛋白質在三維結構上也會具有很高的相似性,我們稱這兩個蛋白質為同源蛋白。當待測蛋白與模板蛋白的序列同源性在50%以上時,兩個蛋白中約有90%以上氨基酸殘基的空間結構是一致的,序列同源性達到30%以上時,同源模建預測得到的結果是可信的。分子對接的本質是通過化學計量學的方法,對結構已知的配體分子與受體分子發生相互結合過程的模擬,明確兩分子在結合時發生的幾何結構以及相互作用力的改變,進而對其相互作用形式與機理進行預測。分子對接能夠準確預測蛋白質受體的活性結合位點與配體的結合形式[20]。

通過對同源模建模型與胡椒單萜類化合物多肽的對接結果的分析,在對以98個同源模建模型,L.monocytogene菌體蛋白(受體)與胡椒單萜類化合物多肽(配體)進行分子對接中,有11個模型具有與胡椒單萜類化合物多肽結合的可能性,并且這些蛋白全部集中在呼吸鏈復合體I和V中。表2是胡椒單萜類化合物多肽結合具有活性的呼吸鏈蛋白,序號1代表同源模建全局模型質量評估(QMQE)得分,序號1為0.7以上,代表建模情況最好,序號2～3為0.5以上,4～11為0.5～0.3。

表2 具有胡椒單萜類化合物多肽對接活性的呼吸鏈復合體Table 2 Respiratory chain complex with docking activity of pepper monoterpenoids and polypeptides

2.6 胡椒單萜類化合物與L. monocytogenes呼吸鏈蛋白分子對接及抑制位點的確定

以L.monocytogenes為供試菌,利用Discovery Studio2.1中的Build and Edit protein,以胡椒單萜類化合物為配體,L.monocytogenes菌體蛋白為受體,進行分子對接,結果得到5條胡椒單萜類化合物與L.monocytogenes菌體蛋白對接成功(如圖4),通過London d G打分函數排序找出具有與胡椒單萜類化合物分子結合活性蛋白,這些蛋白質全部集中在L.monocytogenes呼吸鏈上復合體I和V中,包括十個肽段,這些肽段與胡椒單萜類化合物的親和能得分較高,考慮空間位阻,疏水作用、氫鍵作用及范德華力判斷其結合活性較為可靠;綜合前文所得復合體V在蛋白水平明顯下調,說明其在翻譯后階段受到強烈調控。

3 結論

相比空白對照組,添加胡椒單萜類化合物可抑制L.monocytogenes的生長,同時Na+-K+-ATPase、Ca2+-ATPase、呼吸鏈復合體I～V活力均降低,其中復合體V在蛋白水平顯著下調,說明其在翻譯及翻譯后階段受到強烈調控。結合同源模建和分子對接的結果,我們推測復合體V是胡椒單萜類化合物對L.monocytogenes呼吸鏈的重要抑制位點。胡椒單萜類化合物可使L.monocytogenes細胞膜通透性發生變化,維持L.monocytogenes正常生命活動的ATP和蛋白質不能及時合成,從而導致菌體衰亡。