三葉青提取物抗ANIT所致小鼠肝損傷作用的研究

李萍 吉薇薇 彭昕

[摘要] 目的 研究三葉青提取物對α-異硫氰酸萘酯（ANIT）所致肝損傷小鼠的保護作用。 方法 2017年1月～2018年2月選擇60只小鼠并隨機分為6組，分別為對照組、聯苯雙酯陽性藥物組、模型組、三葉青提取物低、中、高劑量組[（1.0、2.0、4.0）g/kg]。采用灌胃ANIT的方式復制急性黃疸型肝炎模型，造模48 h后測其血清中ALT、AST、TBA、TBIL、TNF-α的含量；檢測肝組織勻漿中SOD、MDA、GSH-Px的水平。 結果 三葉青提取物各劑量組均可顯著降低TBIL和TNF-α水平（P<0.05），中、高劑量組可以降低血清中ALT、AST、TBA、TBIL、TNF-α含量（P<0.05），各劑量組均顯著降低MDA含量，中、高劑量組可顯著提高SOD活性（P<0.05），而GSH-Px水平無顯著變化。結論 三葉青提取物對ANIT所致小鼠肝損傷有一定的保護作用，其保護作用可能與減輕炎癥因子產生、促進總膽紅素的代謝、降低脂質過氧化程度有關。

[關鍵詞] 三葉青；ANIT；肝損傷；抗氧化

[中圖分類號] R969.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2018）30-0032-04

[Abstract] Objective To study the protective effect of trifolium extract on liver injury induced by α-isothiocyanatoacetate （ANIT） in mice. Methods 60 mice from January 2017 to February 2018 were randomly divided into 6 groups， including control group， bifendate positive drugs group， model group， trifolium extract low， medium and high dose groups[（1.0， 2.0， 4.0） g/kg]. The model of acute jaundice hepatitis was reproduced by intragastric administration of ANIT. The levels of ALT， AST， TBA， TBIL， and TNF-α in serum were determined 48 h after modeling. The levels of SOD， MDA， and GSH-Px in liver homogenate were measured. Results The levels of TBIL and TNF-α were significantly decreased in each dose group（P<0.05）. The levels of ALT， AST， TBA， TBIL and TNF-α in serum were decreased in medium and high dose groups（P<0.05）. Each dose group significantly decreased the MDA content. The medium and high dose group could significantly increase SOD activity（P<0.05），while GSH-Px levels did not change significantly. Conclusion Trifolium extract has a protective effect on liver injury induced by ANIT in mice. Its protective effect may be related to the reduction of inflammatory factors， promotion of the total bilirubin metabolism and reduction of the lipid peroxidation degree.

[Key words] Trifolium； ANIT； Liver injury； Antioxidant

急性黃疸型肝炎是各種誘因導致肝細胞腫脹、變性，從而引起膽紅素的排泄障礙，進而形成黃疸的肝臟損傷疾病，除了皮膚黃染、低熱、食欲不振、尿黃等表征外，還伴有總膽紅素、多種轉氨酶等臨床生化指標的升高[1]。中醫對黃疸型肝炎的治療具有悠久的歷史，多以清熱解毒、利濕退黃、活血化瘀、疏利肝膽論治[2]，能夠一定程度地緩解患者細膽管的淤膽和膽栓的形成，從而清除患者體內的集聚膽汁[3]。

三葉青是我國特有珍稀植物三葉崖爬藤（Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg）的塊根，具有清熱解毒、防癌護肝等多種功效，常用于高熱驚厥、肝炎、風濕、肺炎、癰疔瘡癤等癥[4]。有研究報道，三葉青具有良好的保肝降酶及抗肝纖維化作用[5]，三葉青多糖對CCl4所致的急性肝損傷具有量效依賴的阻抗作用[6]，前期本課題組的研究表明，三葉青提取物能誘導人肝內膽管癌HCCC-9810細胞凋亡[7]。本文利用α-異硫氰酸萘酯（ANIT）所致小鼠肝損傷模型，探討其對急性黃疸型肝炎的潛在功效，為其臨床應用提供藥理學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

2017年1月～2018年2月期間，60只昆明種雄性SPF級小鼠，體重（18±3）g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司。每日12 h照明，保持環境溫、濕度分別為（25±2）℃、（55±5）%。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 異硫氰酸萘酯（ANIT）購自西格瑪奧德里奇貿易有限公司；聯苯雙酯滴丸購自浙江醫藥股份有限公司新昌制藥廠；膽汁酸（TBA）、丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（AST）、總膽紅素（TBIL）檢測試劑盒，超氧化物歧化酶（SOD），考馬斯亮藍試劑盒、丙二醛（MDA）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）檢測試劑盒均購自寧波航景生物科技有限公司；腫瘤壞死因子（TNF-α）酶聯免疫吸附測定試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒購自碧云天生物科技公司。

1.2.2 藥品制備 稱取干燥三葉青藥材粉末10 g，用200 mL 80%乙醇加熱回流提取3次，每次45 min，合并提取液，減壓旋轉濃縮至50 mL，小鼠灌胃量20、10、5 mL/kg則分別制得高、中、低劑量（按生藥計為4.0、2.0、1.0 g/kg）。給藥劑量參考成人臨床常規用量確定。

1.2.3 動物分組與給藥 60只小鼠按每組10只隨機分為6組，分別為對照組、模型組、聯苯雙酯陽性藥物組，低、中、高劑量（1.0、2.0、4.0 g/kg）組。連續給藥10 d，對照組和模型組灌胃生理鹽水，陽性藥物組給予聯苯雙酯溶液（0.15 g/kg），低、中、高劑量組分別給予相應濃度的提取物，第8天給藥1 h后造模，對照組給予花生油灌胃15 mL/kg，其他各組小鼠灌胃100 mg/kg ANIT（用花生油75 mL溶解0.5 g ANIT制得），灌胃前、后分別禁食16 h、4 h。

1.3 檢測指標測定

造模48 h后小鼠眼靜脈叢取血，采血前禁食12 h，全血在4℃，5000 r/min，離心5 min，取上層血清置4℃貯存備用，檢測血清中ALT、AST、TBA、TBIL、TNF-α含量。取血后處死小鼠并迅速分離肝臟，取相同部位的肝組織，經10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，HE染色，顯微鏡下比較各組病理組織的形態學變化差異；并采用比色法檢測肝組織勻漿中SOD，MDA、GSH-Px的活性/含量。

1.4 統計學處理

采用SPSS17.0軟件進行統計學分析，計量資料以（x±s）表示，多組間采用One-way ANOVA方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三葉青提取物對ANIT致肝臟病理組織學變化的影響

如封三圖2所示，HE染色可見正常組小鼠肝臟組織細胞形態正常，肝索及肝血竇排列規則，無炎性細胞浸潤。模型組肝小葉結構模糊，大量肝細胞擴張并含有大量紅細胞游積，脂滴空泡，可見點狀壞死。聯苯雙酯陽性藥組和各給藥組均能不同程度地減輕肝臟受損程度。肝小葉結構基本正常，肝竇結構較清晰，肝索基本呈放射狀排布，鏡下雖可見少量炎性細胞浸潤，但與模型組相比有明顯改善。

2.2 三葉青提取物對肝損傷小鼠血清ALT、AST、TBA、TBIL、TNF-α含量的影響

模型組小鼠肝功能和TNF-α 5項指標的水平均較正常對照組顯著增加（P<0.05），表明造模成功。聯苯雙酯陽性藥物組ALT、TBIL、TNF-α 3項指標水平較模型組均顯著下降（P<0.05），AST、TBA水平無顯著變化；低劑量組（1 g/kg）的TBIL和TNF-α水平顯著下降；中、高劑量組（2、4 g/kg）均可使血清ALT、AST、TBA、TBIL、TNF-α水平顯著下降（P<0.05）。見表1。

2.3 三葉青提取物對ANIT致肝損傷小鼠肝勻漿SOD、MDA、GSH-Px活性的影響

從表2結果可知，模型組SOD、GSH-Px 2項指標的活性均較對照組顯著降低（P<0.05），而MDA含量較對照組顯著升高（P<0.05）。聯苯雙酯陽性藥物組SOD、GSH-Px 2項指標的活性均較模型組顯著升高（P<0.05），而MDA含量較模型組顯著下降（P<0.05）；三葉青高劑量組（4 g/kg）可顯著提高SOD活性，并顯著降低MDA含量，低、中劑量組（1、2 g/kg）均可顯著降低MDA含量（P<0.05），GSH-Px 水平無顯著變化。見表2。

3 討論

異硫氰酸萘酯（ANIT）致小鼠肝損傷是常用的急性黃疸型肝炎模型。ANIT進入體內后，先發生膽管周圍微環境的改變，巨噬細胞和樹突狀細胞受刺激后觸發免疫作用[8]，肝中出現上皮增生，并損傷膽管上皮細胞，使膽汁淤積、膽管阻塞，引起肝內膽管增生及周圍炎癥，從而導致高膽紅素血癥和膽汁分泌減少，最終產生肝臟毒性[9]。

丙氨酸轉氨酶（ALT）和天冬氨酸轉氨酶（AST）是主要分布在肝細胞質內的可溶性酶，肝臟受損后肝細胞中的轉氨酶便釋放入血，血清中ALT和AST水平高低常作為判定肝損傷程度的重要指標。丙二醛（MDA）是生物體內自由基作用于脂質發生過氧化反應產生的代謝終產物，具有細胞毒性，其含量可反映體內氧自由基生成量及活性，從而間接反映機體和細胞的受損程度[10]。過多的活性氧攻擊肝細胞膜而致脂質過氧化反應，同時耗竭肝細胞內重要的抗氧化酶[11]，SOD和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）均是機體主要的氧自由基清除酶，是肝、肺等多種組織重要的抗氧化防御因子[12]，能夠清除活性氧自由基及其誘發的脂質過氧化物，保護細胞膜結構和功能的完整性。由肝巨噬細胞分泌的TNF-α是一種重要的促炎因子和免疫調節因子[13]，通過誘導肝細胞凋亡和其他炎癥因子的生成，引起肝小葉受損，ALT和AST水平明顯升高，促進細胞內中性粒細胞浸潤，增加氧自由基的釋放，還可誘導IL-1、IL-8等細胞因子釋放[14]，破壞機體的免疫平衡，是參與各種肝臟疾病發生與發展的關鍵因子[15，16]。

黃疸型肝炎病程長，部分病例退黃較難。病因從西醫角度多為膽紅素生成過多、肝細胞功能較低、膽汁瘀積等，多采用腎上腺皮質激素等治療，而長期應用激素會發生多種嚴重的副作用，且臨床應用的禁忌證較多。中醫角度認為黃疸型肝炎為“濕、熱、毒、瘀”引起的渾濁阻滯，肝膽功能失調引起的肝膽病癥。近年來中醫藥在治療黃疸型肝炎方面的臨床報道日趨增多，主要涉及清熱、祛濕、瀉下、補虛、理氣、解表6大類[17]，以清熱解毒，利濕化痰，退黃保肝之法為主[18]。如茵陳蒿湯、茵梔黃顆粒、酢漿草白茅根煎劑等[19]，中醫治療黃疸雖有明顯療效和特色，然而目前的研究多為臨床療效觀察，對藥物作用機制的研究尚不清晰。三葉青具有清熱解毒、祛濕化痰、活血止痛等傳統功效，民間用于抗小兒高熱、黃疸型肝炎、腦膜炎等[20]，可充分發揮其調節免疫、抗病毒、促進肝臟修復的作用，然而其作用機制尚缺乏現代藥理學實驗研究。從本研究結果可知，三葉青提取物各劑量組均可顯著降低TBIL和TNF-α水平（P<0.05），中、高劑量組可以降低血清中ALT、AST、TBA、TBIL、TNF-α含量（P<0.05），并且降低水平存在一定的量效關系。表明其可通過減輕炎癥因子產生，促進總膽紅素的代謝，減少膽汁酸（TBA）的積累而減輕肝細胞受損和壞死的程度[21]。另一方面，三葉青各劑量組均顯著降低MDA含量，中、高劑量組可顯著提高SOD活性，而GSH-Px水平無顯著變化，表明其可以通過提高肝細胞中抗氧化酶活性，抑制肝細胞發生脂質過氧化等來改善肝損傷情況。

本研究結果為三葉青保肝作用的進一步開發利用提供了相關實驗依據，綜合運用中西醫不同的退黃措施并促使其互為補充以提高療效的臨床研究，有待更進一步的深入研究。

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（收稿日期：2018-03-30）