葛根芩連湯對潰瘍性結腸炎小鼠模型腸黏膜內NF-κB、TNF-α、MFG-E8及occludin表達的影響

陳 麗

(四川省安岳縣人民醫院消化內科，四川 安岳 642350)

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種以腹痛、腹瀉、粘液血便等為主要臨床表現的發生于結、直腸的非特異性炎癥疾病[1]。中醫將UC歸為“泄瀉”、“大瘕瀉”等范疇，飲食不節、外感濕熱之邪、情志失調等因素所致的脾胃虛弱為發病之本，脾胃虛弱則致水谷不化、后天失養，臟腑機能失調以致氣血生化無源、運化無力，濕熱內蘊、壅滯腸間、搏結氣血則致脂絡受傷、腐敗成瘍，發為UC。目前多采用水楊酸類、免疫抑制劑和糖皮質激素治療UC，取得了一定效果，但存在療效不穩定、用藥時間長、副作用較大等問題[2]。中醫對UC有完整的辯證及施治體系，《傷寒論·太陽病脈證并治》中便有以葛根芩連湯主治協熱下利的論述[3]。本研究觀察葛根芩連湯對UC小鼠的影響，探討葛根芩連湯對小鼠UC的療效及治療機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1材料雌性balb/c小鼠(川北醫學院動物實驗中心)40只，均為無特定病原體級(SPF)，體重18～20 g，6～7周齡。葡聚糖硫酸鈉(Dextran Sulfate Sodium，DSS，北京聯立信生物技術有限公司)。葛根芩連湯：葛根15 g，黃芩、黃連各9 g，甘草6 g。柳氮磺吡啶(sulfasalazine，SSZ，上海中西三維藥業有限公司，規格：0.25 g，批準文號：國藥準字H31020450)。兔抗鼠Anti-NF-κBP65多克隆抗體、兔抗鼠Anti-MFG E8/BA 46多克隆抗體、兔抗鼠Anti-OCLN/occludin多克隆抗體、SA1022-兔Ig G SABC免疫組化染色試劑盒、DAB顯色試劑盒，均來自博士德生物工程有限公司；兔抗鼠Anti-TNF-α多克隆抗體來自博奧森生物科技有限公司。蛋白質抽提試劑盒及PCR提取試劑盒均購自廣州英偉創津公司。引物(β-actin)由上海森工及大連寶生物有限公司合成。美國Bio-Tek公司Epoch連續波長酶標儀，National Institutes of Health Image J 2.1.4.7，BIORAD電泳儀，Odyssey CLX紅外熒光掃描成像系統。

1.2實驗分組及動物模型建立將40只balb/c小鼠分為A組(空白對照組，蒸餾水，n=10)、B組(模型組，DSS+蒸餾水，n=10)、C組(SSZ組，DSS+SSZ，n=10)及D組(葛根芩連湯組，DSS+葛根芩連湯，n=10)。小鼠適應性喂養7d后，除A組外，B、C、D各組小鼠均連續7 d予以5%DSS(分子量36000～50000)溶液代替飲用水供其自由飲用，隔天更換一次。造模同時相應藥物灌胃或予以蒸餾水，劑量3 μg/g·d，持續7 d。

1.3觀察及取材每日觀測、記錄的小鼠的體重、大便性狀和便血情況，記錄疾病活動指數(DAI)評分[4]，評分標準：包括體重下降、大便性狀、出血3個方面，體重下降0%、1%～5%、5%～10%、10%～15%、>15%分別記0～4分，大便性狀正常、松散、稀便分別記0、2、4分，大便隱血正常、隱血陽性、肉眼血便分別記0、2、4分；DAI=體重下降+大便性狀+出血得分。第8 d采取頸椎脫臼法處死各組小鼠。剖開小鼠腹部，迅速取出整個結腸段，測定結腸長度及濕重，觀察結腸充血、水腫、大便團分布等情況，解剖出小鼠脾臟，計算脾指數。取材1：于距結腸末端5 mm或10 mm處橫切切取一段5 mm左右直腸，縱行剖開于PBS液漂洗2次，然后經液氮罐轉入-70 ℃冰箱保存，用于分子生物學檢測；其余結腸浸潤固定于10%的福爾馬林溶液中，24 h后轉入70%保存(4 ℃)。取材2：對于固定后的結腸，首先把另一段直腸(5 mm長，距肛門5 mm或10 mm)橫切成等高的2段，包埋于石蠟中。其余剩下的近胃端結腸則等距隨機取2塊(橫切，碰到大便位置在大便旁邊切)，包埋在一起。

1.4病理組織學檢測取結腸組織石蠟塊行4 μm連續組織切片，烤片，HE染色，光鏡下觀察結腸組織病理損傷，并進行組織損傷評分[5]。

1.5免疫組化法檢測將結腸組織石蠟塊行3 μm連續切片，置于58～60 ℃烤箱中30～60 min，使切片組織緊密粘附于過多聚賴氨酸處理后的載玻片，實驗步驟為切片脫蠟、脫水、滅活、抗原修復、封閉、滴加一抗、沖洗、DAB顯色、復染、脫水、透明、封片。采用Image J 2.1.4.7軟件測量免疫組織化學圖像平均灰度值，NF-кB、TNF-α、MFG-E8及occludin等陽性物質平均灰度值越低提示其含量越高。

1.6結腸黏膜NF-кB、TNF-α、MFG-E8及occludin蛋白表達定量檢測取結腸組織，液氮研磨，加RAPI裂解液，置于冰上，超聲組織破碎儀提取蛋白，10 min后，12000 rpm/min離心15 min，取上清液，采用Western-bloting技術定量檢測NF-кB、TNF-α、MFG-E8及occludin的表達情況。

1.7統計學方法采用SPSS 19.0軟件對數據進行統計分析。計量數據以均數±標準差表示，組間比較采用F檢驗及SNK-q檢驗。P< 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1DAI評分、組織損傷評分及病理形態學觀察

B、C、D組建模第7d時DAI評分、建模第8d時組織損傷評分均大于A組，且B組大于C、D組(P< 0.05)；C、D組上述評分比較，差異無統計學意義(P> 0.05)。見表1。A組鏡下可見腸黏膜、腺體結構層次清楚、完整，無或極少炎癥細胞浸潤(圖1a)。B組鏡下可見腸黏膜組織細胞、腺體結構遭受不同程度破壞，層次結構不清，排列紊亂，伴廣泛炎癥細胞浸潤，主要累及黏膜和黏膜下層(圖1b)。C組鏡下可見腸黏膜組織細胞、腺體結構遭受破壞程度顯著較B組輕，浸潤的炎癥細胞數量顯著較B組少，黏膜結構有不同程度恢復(圖1c)。D組鏡下可見腸黏膜組織細胞、腺體結構遭受破壞程度與C組相近，浸潤的炎癥細胞數量顯著較B組少，黏膜結構有不同程度恢復(圖1d)。

表1 四組DAI評分、組織損傷評分比較 (分)

a與A組比較，P < 0.05；b與B組比較，P < 0.05

圖1 各組小鼠病理形態學觀察(HE染色) a：A組； b：B組； c：C組； d：D組

2.2結腸長度、結腸質量及脾指數建模第8 d時，A、C、D組結腸長度大于B組，結腸質量、脾指數小于B組(P< 0.05)；且A、C、D上述指標檢測結果比較，差異無統計學意義(P> 0.05)，見表2。

表2 四組結腸長度、結腸質量及脾指數比較

a與A組比較，P < 0.05；b與B組比較，P < 0.05

2.3結腸黏膜免疫組織化學圖像觀察及NF-кB、TNF-α、MFG-E8及occludin平均灰度值比較建模第8d時，四組結腸黏膜NF-кB、TNF-α平均灰度值水平均顯示A>C>D>B，MFG-E8、occludin平均灰度值水平均顯示A

圖2 NF-кB免疫組化圖 a：陰性對照圖；b：A組；c：B組；d：C組；e：D組

表3 四組結腸黏膜NF-кB、TNF-α、MFG-E8及occludin平均灰度值比較

a與A組比較，P < 0.05；b與B組比較，P < 0.05；c與C組比較，P < 0.05

圖3 TNF-α免疫組化圖 a：陰性對照圖；b：A組；c：B組；d：C組；e：D組

圖4 MFG-E8免疫組化圖 a：陰性對照圖；b：A組；c：B組；d：C組；e：D組

圖5 occludin免疫組化圖 a：陰性對照圖；b：A組；c：B組；d：C組；e：D組

2.4結腸黏膜NF-кB、TNF-α、MFG-E8及occludin蛋白相對表達情況建模第8d時，四組結腸黏膜NF-кB、TNF-α蛋白相對表達量均顯示AC>D>B，差異均有統計學意義(P< 0.05)，見表4。

表4 四組結腸黏膜NF-кB、TNF-α、MFG-E8及occludin表達情況比較

a與A組比較，P < 0.05；b與B組比較，P < 0.05；c與C組比較，P < 0.05

3 討論

近年UC發病率隨人們飲食結構的改變和生活水平的提高呈上升趨勢，且UC易反復發作，多遷延日久，易對患者身心健康造成嚴重影響[6]。UC的發病機制尚未闡明，相關研究顯示其與炎癥反應、腸道屏障功能缺陷和菌群失調等因素有關[7]。

常規水楊酸類、免疫抑制劑和糖皮質激素治療雖取得了一定效果，但存在療效不穩定、用藥時間長、副作用較大等問題[8]。葛根芩連湯作為中藥湯劑，可針對UC患者脾胃虛弱為本，濕熱內蘊、痰濕停滯、瘀血阻滯為標的主要病理特點，提出了外疏內清、表里同治的治療方法[9]。本研究中，予葛根芩連湯的D組UC小鼠DAI評分、組織損傷評分均低于未予治療的B組，且上述評分與予SSZ的C組差異無統計學意義，結腸長度、結腸質量及脾指數與A組差異無統計學意義，提示葛根芩連湯對減輕UC小鼠病變程度和結腸組織損傷范圍有一定幫助。

脾主運化、統血，正常情況下，機體脾氣健運，機體消化吸收、水谷精微輸布功能健全，從而維持正常的生理活動。UC患者因患病日久濕毒瘀滯、情志內傷等因素而正虛邪實，脾氣不足則致脾失健運，水谷不運，氣血生化無源，使患者出現消瘦乏力、面色無華、泄瀉等癥。同時，脾氣不足亦可致中氣下陷，內臟下垂，引起肛門墜脹等癥。方中以葛根為君，辛甘而涼，入脾胃經，既能解表退熱，又可輕清升散，升舉脾胃清陽之氣，使津液布行，止瀉止痢。黃連、黃芩共為臣藥，行清熱燥濕、瀉火解毒、厚腸止利之功，有效改善UC所致濕熱中阻、痞滿、瀉痢等癥。藥理研究顯示，葛根芩連湯具有良好的解熱、抗菌、抗病毒、抗氧化應激、解痙及增強免疫作用[10]，適用于對UC的治療。

文獻顯示，Toll樣受體(TLRs)/NF-κB信號傳導通路參與了UC發病機制，在調節涉及黏膜炎癥反應中起核心作用[11]。NF-κB抑制因子磷酸化IκB炎癥信號刺激下被泛素化降解，從細胞膜向細胞核轉位，調控C-MYC、CDK1等下游相關靶基因釋放，參與細胞周期、凋亡、癌變。TLRs/NF-κB的過度激活亦將導致TNF-α、IL-6、IL-8等炎癥介質的過度表達，引起炎癥反應，造成腸黏膜屏障的損傷。TNF-α可誘導白細胞粘附分子的表達使白細胞募集，誘導免疫細胞的增殖和分化，產生一氧化氮分子，并可激活NF-κB，形成惡性循環，直接或間接導致腸黏膜屏障損傷[12]。MFG-E8作為一種親脂性糖蛋白，可使損傷的腸黏膜上皮細胞在其促腸上皮細胞遷移作用下加速修復，并可與磷脂酰絲氨酸結合，誘發潰瘍邊緣腸上皮細胞肌動蛋白細胞骨架的重構[13]。occludin蛋白則是構成腸黏膜上皮細胞間緊密連接的主要蛋白，對阻止有害物質滲入黏膜下層有重要意義，因此其表達情況可反映黏膜屏障功能的變化[14]。本研究中，予以葛根芩連湯治療的D組UC小鼠結腸黏膜NF-кB、TNF-α、MFG-E8及occludin平均灰度值、蛋白相對表達量改善情況雖不及予以SSZ治療的C組，但顯著均優于未予以治療的模型組，提示該中藥湯劑對改善腸道炎癥反應、促進腸黏膜修復有一定幫助。祁燕等[15]采用具有健脾勝濕、清熱解毒的中藥湯劑治療UC小鼠，發現其可有效減輕炎癥反應，促進腸黏膜修復，與本研究基本一致。

綜上所述，葛根芩連湯可減輕UC小鼠病變程度和結腸組織損傷范圍，改善腸道炎癥反應，促進腸黏膜修復，對UC治療有重要意義。