安立生坦對低氧性肺動脈高壓大鼠肺血管平滑肌細胞增殖與凋亡的影響

宋 強，胡 志，王 軍，范粉靈，王宇星，張玉順

(1.西安交通大學第一附屬醫院結構性心臟病科，陜西 西安 710061；2.陜西省人民醫院，陜西 西安 710061)

低氧性肺動脈高壓(hypoxic pulmonary hypertension，HPH) 是臨床眾多心肺疾病發展過程中的重要改變，以低氧性肺血管收縮(HPV) 和低氧性肺血管重建(HPSR) 為其主要的病理生理特征[1]。其中平滑肌細胞增殖引起的低氧性肺血管重建是藥物治療不佳的主要原因，如何減輕及逆轉血管的重構成為治療HPH 的關鍵[2]。安立生坦(ambrisentan)是一種高選擇性內皮素受體拮抗劑，口服不僅能夠降低肺動脈壓力，而且對肝損害較小。為臨床肺高壓治療藥物中的新星[3]。有文獻報道安立生坦在特發性肺動脈高壓和硬皮病相關性PAH中治療中的持續作用[4]，但關于HPH作用罕有報道。本研究通過建立HPH大鼠模型，給予安立生坦干預，觀察其對肺動脈高壓大鼠肺血管平滑肌增殖與凋亡的影響，進而探討其治療肺動脈高壓的可能分子機制，并為臨床上使用高選擇性內皮素受體拮抗劑是否改善肺血管重塑提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1材料實驗時間2016年4～8月，健康成年雄性SD大鼠40只，體重200～250 g，購于西安交通大學醫學院實驗動物中心。安立生坦(H20130365 Ambrisentan 凡瑞克)為葛蘭素史克公司產品，兔抗大鼠Bcl-2，Caspase-3多克隆抗體和β-Actin抗體為美國Abcam公司產品，SP免疫組化試劑盒為北京中杉金橋生物技術有限公司產品，全自動調節低壓低氧倉由第四軍醫大學生理實驗室提供，RM-6200多道智能生理信號記錄系統為成都儀器廠產品。

1.2模型建立在40只SD大鼠中隨機選30只大鼠于低壓低氧艙中飼養2周，8 h/d，再隨機分為模型組、藥物治療組、安慰劑組各10只。HPH動物模型的建立采用李娟等[4]報道的方法。從第3周起，模型組繼續在艙中飼養，藥物治療組大鼠每天進艙前給予凡瑞克5 mg/kg灌胃，安慰劑組大鼠于進艙前給予生理鹽水2 ml灌胃；至第4周結束為實驗終點，剩余10只作為對照組，正常環境中飼養4周。

1.3肺血流動力學測定實驗滿4周后，按Pei[5]等報道的方法，自大鼠右頸外靜脈插入聚乙烯塑料管，導管另一端與微型壓力傳感器相連，導管進入肺動脈干。采集、記錄及分析指標大鼠平均肺動脈壓力(mPAP)，計算右心肥厚指數RV/(LV+S)。

1.4肺小動脈形態學分析在400倍光鏡下觀察并拍片，每張切片連續觀察肺組織中型肺動脈或小型肺動脈，應用Nikon &Spot 圖像分析系統進行檢測：RMT為T(肺理想血管中膜厚度)與R(外彈力層包繞的理想血管半徑)之比，T為R與r(內彈力層包繞的理想血管半徑)之差。每只大鼠測5～10個，求其均值。

1.5肺動脈Bcl-2免疫組織化學染色法將肺組織石蠟切片常規脫蠟，孵育、修復抗原、恒溫箱中封閉1 h后，依次滴加一抗即Bcl-2多克隆抗體(1：200)，Caspase-3多克隆抗體(1：300)、生物素化的羊抗兔IgG及辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素，最后經顯色及復染。采用Motic醫學圖像采集和分析系統，對Bcl-2和 Caspase-3的定位及表達進行分析，放大倍數×400，隨機選取5個視野，利用圖像分析系統測得平均灰度。

1.6Bcl-2、Caspase-3蛋白表達定量測定常規提取總蛋白，進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜，封閉60 min。加入一抗(Bcl-2：1：500；Caspase-3：1：800)，β-αctin：1：8000)，4℃過夜。加入酶標記二抗(1：8000)，37℃孵育1小時。發光劑曝光并拍照記錄。以Quantity One成像分析系統進行WB條帶的灰度值分析。

1.7統計學方法采用SPSS 18.0統計軟件進行數據分析。計量數據均采用均數±標準差表示，數據先進行正態性檢驗，符合組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，不符合進行對數轉換。P< 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1HAEPH模型的確認大鼠血流動力學、右心室肥厚的指標模型組mPAP、RVSP明顯高于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)；藥物治療組mPAP、RVSP較模型組、安慰劑組顯著降低，差異均有統計學意義(P<0.05)，藥物治療組與對照組相比較，差異無統計學意義(P> 0.05)。見表1。

表1 各組大鼠對HPH大鼠血流動力學的影響的比較(n=10)

a與對照組比較，P< 0.05；b與模型組比較，P< 0.05；c與安慰劑組比較，P< 0.05

2.2肺動脈形態學指標的變化對照組大鼠動脈內膜完整光滑、管壁薄、管腔大、肌層無增厚(圖 1)；模型組與安慰劑組大鼠出現肺動脈中層增厚、細動脈肌型化、血管內膜細胞增殖及管腔變窄等肺血管重構的變化。而藥物治療組大鼠肺動脈的管壁厚度、管腔大小恢復至對照組的狀態，表明肺動脈重構得到抑制及逆轉。與模型組和安慰劑組比較，藥物治療組HPH大鼠管壁面積占血管總面積的百分比(WA%)、肺血管管壁厚度占外徑的百分比(WT%)均顯著降低(P< 0.05)；與對照組比較，模型組和安慰劑組HPH大鼠WA%、WT%均顯著增高(P< 0.05)，藥物治療組差異無統計學意義(P> 0.05)，見表2。

圖1 各組大鼠肺小動脈形態學變化的觀察 (HE染色，×400) A：模型組；B：藥物治療組；C：安慰劑組；D對照組

表2 各組大鼠WA%和WT%的比較(n=10)

a與對照組比較，P< 0.05；b與模型組比較，P< 0.05；c與安慰劑組比較，P< 0.05

2.3大鼠肺動脈Bcl-2蛋白的表達與對照組相比，模型組大鼠肺組織Bcl-2蛋白的表達顯著增加(P< 0.05)；與模型組相比，藥物治療組 Bcl-2的表達量減少(P< 0.05)；藥物治療組肺動脈平滑肌Bcl-2與對照組差異無統計學意義(P>0.05)，見圖2，圖3，表3。

圖2 各組大鼠肺組織中Bcl-2蛋白分布和表達的免疫組化染色檢測(免疫組化染色，×400) A：模型組；B：藥物治療組；C：安慰劑組；D：對照組

圖3 各組大鼠肺組織中Bcl-2蛋白的相對表達量的比較 A：模型組；B：藥物治療組；C：安慰劑組；D：對照組。與對照組比較，aP < 0.05；與模型組比較，bP < 0.05；與安慰劑組比較，cP < 0.05

表3 各組大鼠肺組織Bcl-2蛋白表達(n=10)

與對照組比較，aP< 0.05；與模型組比較，bP< 0.05；與安慰劑組比較，cP< 0.05。

2.4大鼠肺動脈中Caspase-3蛋白表達免疫組化染色法及Western Blot結果均顯示與對照組相比，模型組肺動脈平滑肌中Caspase-3的表達明顯降低(P< 0.05)；與模型組相比，藥物治療組肺動脈平滑肌Caspase-3的表達顯著升高(P< 0.05)；藥物治療組肺動脈平滑肌Caspase-3與對照組表達差異無統計學意義(P>0.05)。見圖4，圖5，表4。

圖4 各組大鼠肺組織中Caspase-3蛋白分布和表達的免疫組化染色檢測(免疫組化染色，×400) a：模型組；b：藥物治療組；c：安慰劑組；d： 對照組

圖5 各組大鼠肺組織中Caspase-3蛋白的相對表達量的比較 A：模型組；B：藥物治療組；C：安慰劑組；D：對照組。與對照組比較，aP < 0.05；與模型組比較，bP < 0.05；與安慰劑組比較，cP < 0.05

表4 各組大鼠肺組織Caspase-3的表達(n=10)

與對照組比較，aP< 0.05；與模型組比較，cP< 0.05；與安慰劑組比較，eP< 0.05

3 討論

HPH是高原地區中的一種常見病、多發病，是以肺動脈壓力升高、低氧血癥為主要特征，其中肺血管重塑是HPH發生、發展的關鍵環節。長期低氧條件時，肺動脈平滑肌細胞生長調控失衡，引發細胞的異常增殖、遷移以及細胞外基質的過度沉積，最終促進肺血管重塑的發生[6]。

在本實驗當中，模型組與安慰劑組SD大鼠的mPAP、RVSP、dP/dtmax及RV/(LV+S)均明顯高于對照組，提示HPH大鼠模型的構建成功。而藥物治療組大鼠的上述指標均明顯低于模型組和安慰劑組大鼠，表明凡瑞克作為ETAR的拮抗劑，能有效地降低HPH大鼠模型肺動脈壓力。肺血管HE染色結果顯示，與對照組相比，模型組與安慰劑組大鼠的肺血管的中層增厚，細動脈肌型化，肺血管內膜細胞增殖，血管腔明顯狹窄，WT%、WA%明顯增高；而藥物治療組的大鼠上述指標顯著改善，提示凡瑞克可有效逆轉HPH中肺血管重塑的作用。

細胞凋亡與細胞增殖的相互作用是影響血管組織重塑的重要因素。正常情況下二者處于相對動態平衡以維持組織的正常形態。當機體處在缺氧、毒素等情況下上述平衡被打破，細胞增殖的數量超過細胞凋亡的數量時就可能出現組織重塑。細胞的凋亡是受基因控制的，Bcl-2作為調控細胞凋亡的重要基因，其蛋白質產物能夠抑制細胞的凋亡。Caspase-3是導致細胞凋亡的最強大、最終效應因子，Caspase-3是細胞凋亡過程中最重要的終末剪切酶[7，8]。Bcl-2通過抑制細胞線粒體PT通道的開放(即線粒體膜電位下降)，從而阻止線粒體細胞色素C的釋放進而抑制Caspase-3的激活，最終達到阻止細胞凋亡的發生，于此同時Bcl-2亦能直接抑制線粒體細胞色素C的釋放從而減少Caspase-3的激活[9～11]。在該實驗中，與對照組相比，模型組Bcl-2的蛋白表達顯著增高，而Caspase-3的蛋白表達顯著降低，提示Bcl-2及Caspase-3的表達失衡共同參與了HPH的發生及發展。與模型組相比，藥物治療組Bcl-2蛋白表達降低，Caspase-3蛋白表達升高，肺血管厚度及管腔大小得到顯著改善，肺血管重塑減輕。以上實驗結果提示凡瑞克抑制肺血管平滑肌增殖、促進其凋亡可能與通過下調Bcl-2蛋白表達有關，從而改變Bcl-2/bax的比例，增加細胞對凋亡信號的易感性，最終肺血管平滑肌細胞發生凋亡[12～14]。據此，我們推測凡瑞克對HPH動物模型肺血管重塑的抑制作用，可能通過抑制Bcl-2，直接和間接兩個方面激活Caspase-3蛋白，誘導肺動脈平滑肌細胞凋亡[15～19]。

綜上，凡瑞克可能是通過抑制低氧SD大鼠肺動脈中Bcl-2的合成、促進Caspase-3的生成，激活凋亡通路，逆轉肺血管的重塑，進而達到治療肺動脈高壓的作用。然而，仍需更多研究進一步明確凡瑞克在治療肺動脈高壓中的相關分子機制。