SNTB1基因多態位點與四川地區漢族人群高膽固醇血癥的相關性分析

楊馭媒，馬 誓，毛元英，張 可，李新麗

(1.成都市第六人民醫院檢驗科，四川 成都 610051；2.四川省醫學科學院·四川省人民醫院檢驗科，四川 成都 610072)

高膽固醇血癥在發展中國家和發達國家都是非常嚴重的健康問題，也是動脈粥樣硬化和心腦血管疾病的重要危險因素[1，2]。隨著生活水平的提高，我國國民生活習慣也發生改變，心腦血管疾病的發病率也越來越高，而血總膽固醇(Total cholesterol，TC)水平升高被認為是冠心病死亡率增加的獨立危險因素[3]。高膽固醇血癥的發生是由環境因素(包括吸煙、運動、飲食等)和遺傳因素共同作用[4]。最近的研究發現，ABCA1基因上多態位點與血脂水平相關[5～7]。SNTB1基因編碼蛋白β1-syntrophin(β1互養蛋白)與ABCA1相互結合所形成的復合體對膽固醇代謝具有調控作用[8]。因此，本文選取SNTB1基因上3個單核苷酸多態性(single-nucleotide polymorphism，SNP)位點，通過病例-對照關聯研究分析其與四川地區中國漢族人群高膽固醇血癥的相關性。

1 對象與方法

1.1研究對象2013年5月至2018年1月，成都市第六人民醫院和四川省人民醫院的門診和住院患者以及健康體檢人群，年齡40～75歲，有嚴重疾病可能影響長期生存的參加者被排除。高膽固醇血癥定義根據2007年中華心血管病學會制定的《血脂異常防治建議》標準：血漿總膽固醇水平≥5.2 mmol/L[9]，問卷調查包括吸煙、家族史等。醫院倫理委員會批準本項研究，研究對象均簽署知情同意書。均為四川地區漢族人群。

1.2生化檢測血漿葡萄糖(GLU)、甘油三脂(TG)、TC、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)的測定：所有受試者空腹(8小時以上)采集靜脈血；所有檢測均在成都市第六人民醫院檢驗科進行。

1.3基因組DNA提取將收集的5 ml人外周血離心去除血清；接著加入0.2%NaCl溶液，輕輕振蕩5～6次，放置于冰上15分鐘，2500 rpm離心30分鐘，收集沉淀物；用0.2%的NaCl溶液洗滌一次；加入10 mMTris-HCl(pH8.0)和10 mM EDTA(4 m1)，10%SDS，25 mg/ml的蛋白酶K和10 mg/ml的RNaseA，其加入量分別為4 ml、16 μl和20 μl，上下顛倒混勻，37 ℃過夜溫育；過夜后，加入4 ml酚/Tris溶液，上下顛倒混勻，3000 rpm離心10分鐘，用氯仿提取兩次，以獲得水相，往其中加l/10，3 M NaAC (pH 5.2)，兩倍體積的無水乙醇，使DNA沉淀；用70%的乙醇洗滌以獲得基因組DNA；溶解于TE中，然后定量測定在260 nm的吸收率。DNA工作液濃度校正至50 ng/μl，置-20 ℃冰箱保存。

1.4PCR擴增針對SNTB1基因上3個標簽SNP位點(rs7839488、rs4395927和rs4455882)，通過NCBI數據庫(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)獲得基因組序列，采用Primer 3.0在線軟件設計引物，由上海生工生物工程有限公司合成(PCR引物序列見表2)。反應體系10 μl，其中DNA模板1.0 μl，上下游引物0.3 nmol/L，dNTP 0.3 mmol/L，Taq酶0.2 μl，MgCl21.5 mmol/L，ddH2O補充至10 μl。PCR反應程序為95 ℃預變性5分鐘，35個循環(94 ℃變性30秒，57 ℃退火30秒，72 ℃延伸30秒)，然后72 ℃延伸7分鐘。

1.5基因分型采用單堿基延伸法(SNaPSHOT)。首先進行PCR產物純化：PCR產物3 μl，加入SAP 2 μl，ExoI酶0.1 μl，SAP 10×Buffer 0.1 μl，ddH2O補充至10 μl；純化反應程序為：37 ℃ 1小時，75 ℃ 15分鐘。第二步進行SNaPSHOT反應：SNaPSHOT MULTIPLEX 1μl，純化好的PCR產物1 μl，SNAPSHOT引物(引物序列見表1)0.2 μl，ddH2O補足5 μl；反應程序：96 ℃ 1分鐘，25個循環(96 ℃ 10秒，50 ℃ 5秒，60 ℃ 30秒)。第三步為第二次純化：上一步反應產物中加入SAP 1.0 μl，程序：37 ℃ 1小時，75 ℃ 15分鐘。最后取上述產物1 μl加入9μl HD，混勻后上ABI 3730XL測序儀檢測基因型，Genemap軟件讀取基因分型情況。

1.6統計學方法所有數據分析使用SPSS 19.0統計軟件。計量資料以均數±標準差表示，組間分析采用t檢驗。Hardy-Weinberg 平衡、等位基因頻率的組間比較采用χ2檢驗，應用多因素回歸分析SNP位點與高膽固醇血癥的相關性，校正年齡、性別、吸煙史，單倍型分析采用Haploview 4.2軟件。P< 0.05為差異有統計學意義。

表1 SNTB1基因SNP位點引物序列情況

2 結果

2.1兩組基本情況比較如表2所示，本研究中高膽固醇血癥(HTC)組766例(男391例)，正常對照(NC)組913例(男456例)。HTC組體重、血壓、血糖、總膽固醇及血脂水平均顯著高于NC組(P< 0.05)。

表2 兩組基本情況統計

*與NC組比較，P< 0.05

2.2SNTB1基因SNP位點與高膽固醇血癥相關性分析SNTB1基因3個SNP位點的基因型分布在病例組和對照組中均符合Hardy-Weinberg平衡(P> 0.05，表3)，說明本研究資料具有群體代表性。其等位基因頻率在病例組和對照組之間具有顯著差異(rs7839488P= 0.0026，rsrs4395927P= 0.00014，rs4455882P= 0.0045，表3)，風險等位基因可以增加對高膽固醇血癥的易感性(OR值分別為1.28、1.36、1.25)，見表3。

表3 SNTB1基因3個SNP位點在病例和對照組中風險等位基因頻率比較

* HWE：Hardy-Weinberg平衡；**P值和OR值為校正年齡、性別等參數之后的結果。

2.3連鎖不平衡和單倍體型分析采用Haploview 4.2 軟件對SNTB1基因3個SNP位點進行分析，結果顯示，這3個SNP位點均處在同一個連鎖不平衡(linkage disequilibrium，LD)區域(圖1)。這3個位點可組成6個不同的單倍體型，其中風險單倍體型GCA可增加高膽固醇血癥患病風險34%(P= 0.00035)，而保護型單倍體型ATG可降低患病風險24%(P= 0.0021)。見表4。

圖1 SNTB1基因3個SNP位點連鎖不平衡圖 圖中方塊的顏色深淺代表SNP位點之間的連鎖緊密程度。a：方塊中數字顯示的是SNP位點之間的D’值；b：方塊中數字顯示的是SNP位點之間的r2值

表4 SNTB1基因3個SNP位點的單倍體型分析

3 討論

本研究基于遺傳因素基因多態性，研究SNTB1基因與高膽固醇血癥發病的關聯。結果發現，SNTB1基因上3個SNP位點(rs7839488、rs4395927和rs4455882)與四川地區漢族人群高膽固醇血癥發病顯著相關。

SNTB1基因位于染色體8q24.12區域，編碼β1互養蛋白(β1-syntrophin)，屬于互養蛋白家族成員之一。互養蛋白家族與抗肌萎縮蛋白(dystrophin)復合物信號通路以及離子通道相關，在多個細胞信號通路受體的激活過程中起作用[10，11]。研究顯示，β1互養蛋白與ABCA1在人成纖維細胞相互結合，影響ABCA1的表達，并調控膽固醇代謝[8]。ABCA1(脂質轉運膜蛋白1，ATP-binding cassette transporter 1)屬于ABC蛋白家族，可介導膽固醇流逝并調節新生HDL的形成[12]，在膽固醇逆轉運過程中起著非常重要的作用[13，14]。ABCA1基因上多態位點可以影響其轉錄和蛋白表達水平，從而引起脂代謝紊亂[15，16]。

結合這些功能研究的結果和遺傳學發現以及我們的實驗結果，說明SNTB1基因多態位點有可能通過調控其轉錄和基因表達，使得其編碼蛋白-β1互養蛋白的水平發生改變，進而影響與ABCA1的結合，參與膽固醇代謝的調節，從而影響高膽固醇血癥的易感性。由此可見，進一步深入研究SNTB1基因上這些SNP位點在其表達過程中的具體調控作用模式，以及SNTB1編碼蛋白的功能，對于我們認識高膽固醇血癥的發病機制具有重要意義，同時也將有助于疾病的早期診斷、預防和靶向治療。