中性蛋白酶酶解海洋魚鱗蛋白的工藝條件

萬婧驚 王青華 唐旭 黃仕新 徐長安

摘要：如何充分利用水產加工廢棄物資源越來越受到重視。文章利用中性蛋白酶酶解海洋魚鱗蛋白制備魚鱗蛋白多肽。通過考察溫度、時間、酶量、料液比等單一因素對水解魚鱗蛋白的影響，確定并設計了L9（34）正交實驗因素和水平，最終獲得了中性蛋白酶酶解魚鱗蛋白優化工藝條件，即酶量4%（質量分數），溫度45℃，時間3h，料液比10%。在此條件下，酶解所得水解度為28.9%。與文獻比較，該工藝條件下水解時間大大縮短。該條件所得蛋白肽段的分子量主要分布在l-6KDa范圍內。由此可見，該優化條件適合規模化生產，所得蛋白肽可以滿足食品、化妝品行業的需求。

關鍵詞：中性蛋白酶;海洋魚鱗;蛋白水解;條件優化

魚鱗是魚真皮層的變形物，占魚體總重的3%～5%，含有豐富的蛋白質和礦物質，魚鱗總重的41%—55%的有機物中，90%以上為膠原蛋白和魚鱗硬蛋白。

中醫自古以來就有使用魚鱗胨治療婦科疾病的歷史。隨著現代科學以及現代營養學的發展，魚鱗作為營養和食療皆優的佳品，越來越受到關注。魚鱗中含有的豐富膠原蛋白被低溫提取作為生物醫用材料原料，具有促進神經再生、創口愈合等功能。其水解產物中也含有大量的活性肽成分，具有促進皮膚新陳代謝、延緩皮膚衰老、預防治療骨關節疾病、降血壓、抗血脂等功效，市場應用前景十分廣闊。

中國是人口與資源大國，漁業和水產加工發達，但加工廢棄物并沒有得到充分利用，每年僅淡水魚鱗廢棄量就達到了30萬噸/年。對其進行合理加工利用，既節約資源、保護環境，又可進一步延伸拓展低值水產加工資源向高值產品轉化的循環經濟技術鏈。

膠原肽的制備方法主要包括化學水解法和生物酶水解法等。前者是利用酸或堿水解膠原蛋白，雖然方法簡單、成本低廉，但水解過程中能破壞氨基酸，營養損失大，產物復雜，且產生的廢水多，生產周期長;后者具有水解效率高、條件溫和、易于控制水解進程等優點。廣泛使用常用的蛋白酶主要有木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶等。中性蛋白酶也被用來水解水產品，張其標等人使用中性蛋白酶水解鰱魚肉糜獲得較優的水解條件，與酸性蛋白酶相比可以獲得更多的氨基酸;肖安風等人應用中性蛋白酶水解巴浪魚，水解10個小時獲得較高水解度。但使用中性蛋白酶水解魚鱗蛋白報道較少，而且耗時較長。李春美等人將中性蛋白酶應用于魚鱗的酶解反應中，經7小時后發現魚鱗消失，水解完成。為適合規模化生產需要，文章采用4因素3水平（L9（34））正交實驗，利用中性蛋白酶酶解海洋魚鱗.優化酶解工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

美國紅魚魚鱗（Sciaenops ocellatus）：購白福建東山，經洗滌、脫脂和脫鈣處理后干燥備用;中性蛋白酶：南寧龐博生物工程有限公司，酶活力20萬U·g-l;化學試劑：購自西隴化工有限公司，其中碳酸氫鈉為食品級，其他均為分析純。凝膠色譜蛋白對照品，購自Sigma，名稱（分子量），Superd-ex 200：Thyroglobulin （669KDa），Ferritin （440KDa），BSA （67KDa），β-Lactoglobulin （35KDa），Cytochrome（13.6KDa），Aprotinin （6512）;Superdex peptide：Cytochrome C（12.5KDa），Aprotinin （6512），Vitamin B12（1355），Gly-Gly-Gly （189），Glycine （75）。

1.2 儀器

電子天平：METTLER TOIJFDO AL104型;烘箱：上海恒一科學儀器公司，DHG-9240A型;酶標儀：美國分子儀器公司，SpectraMax M5型;pH計：Sartorius PB-10型。凝膠色譜柱：美國GE公司，Superdex 200 10/300 GL，柱體積23.56 mL;Su-perdex peptide 10/300 GL，柱體積23.56 mL。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗工藝流程

脫脂、脫鈣干魚鱗一稀碳酸氫鈉溶液浸泡一蒸餾水清洗并調至中性一加熱預處理lOmin一調pH一酶水解一滅酶一測定水解度

1.3.2 分析方法

1.3.2.1 總蛋白含量：微量凱氏定氮法。

1.3.2.2 水解液游離氨基酸總量：茚三酮顯色法。

1.3.2.3 水解度的計算

DH=xl00%

1.3.3 單因素對酶解效果的影響

分別稱取備用的魚鱗4份，預處理后調整體積以及pH至6.0，加入實驗設計用量的中性蛋白酶，在實驗溫度下進行酶解反應，觀察并記錄魚鱗完全水解所需時間或測定水解度，用以考察酶用量、溫度、料液比和時間對酶解效果的影響。

2 結果與討論

2.1 酶用量對魚鱗水解速度的影響

取4份5.0 g處理備用的干魚鱗，按料液比為1：10經預處理后，分別加入0.05，0.1，0.2，0.3g中性蛋白酶，根據作者前期工作結果以及文獻報道，調pH至6.0左右，于50℃酶解，觀察并記錄魚鱗完全水解所需時間，考察酶量對水解效果的影響，結果見圖l。

由圖l可看出.酶解時間隨著酶量的增加而呈降低趨勢，而酶量從0.2g增加到0.3g時，水解時間對酶量曲線的斜率變小，二者水解時間幾乎沒有相差，表明如果酶量再增加的話，其對酶解的影響將逐漸減小，可能是由于酶量的增加，蛋白中的肽鍵大量斷裂，也產生不少氨基酸或副產物，對酶活性部位不同程度地產生抑制作用，使得蛋白酶的酶促作用有所下降。同時，隨著酶用量的增加，0.2g到0.3g，酶解時間縮短的幅度減小情況下，成本增加了50%。因此，從經濟成本角度考慮，確定酶用量0.2g，即4%（質量分數，下同）。

2.2 溫度對魚鱗水解速度的影響

取4份5.0g處理備用的干魚鱗，按料液比為1：10經預處理后，分別加入0.2 g中性蛋白酶，調pH 6.0，分別于30，40，50，60℃進行酶解，觀察并記錄魚鱗完全水解所需時間，考察溫度對酶解效果的影響，結果見圖2。

在圖2中，在實驗的設定范圍內隨著反應溫度的增加，從30℃升至40℃時，酶解完成時間基本不變，為4h左右。當溫度為50℃時，水解時間迅速變短至最低，之后溫度上升，酶解完成時間反而變長。反應溫度較低時，反應體系粘度大，底物分子與酶分子相互接觸較為困難。故反應速度較慢：隨著反應溫度的上升，溶液的粘度下降，分子運動的速度加快，底物分子中的反應鍵或基團與酶的活性部位相接觸的機會大大增加，酶活增強，反應速度增大，至50℃時，酶活性最佳。此后，當溫度再升高至60℃時，由于升高溫度引起的酶熱失活增加，從而降低了酶的有效濃度，反應速度又呈下降趨勢。故選取50℃為酶水解溫度最適水平參考點。

2.3 料液比對酶解的影響

分別取1.0， 5.0，10.0，15.0g魚鱗，加入50mL水經預處理后，加入0.2g中性蛋白酶，調pH6.0，于50℃進行酶解，觀察并記錄魚鱗完全水解所需時間，考察料液比對酶解效果的影響，結果見圖3。

在恒溫水解反應過程中，動力學參數a值是一個跟初始蛋白酶濃度與初始底物濃度的比值.由圖3可以看出，固定初始中性蛋白酶的濃度，酶解效率隨著料液比的增加而降低，符合該動力學模型。在實驗設計的4個條件中，料液比為20%（質量分數，下同）和30%時反應速度都比較慢，所用時間都比較長，。當濃度較高時，反應體系粘度大，底物分子與酶分子相互接觸較為困難，故反應速度較慢;隨著料液比的降低，溶液的粘度下降，分子運動所受的阻力減小，速度加快，底物分子中反應鍵或基團與酶活性部位相接觸的機會大大增加，反應速度增大。雖然料液比為5%與10%時的速度比較快而且相當，但是溶液過稀也會大大增加生產成本。因此，綜合考慮10%為參考點。

2.4 酶解時間對水解度的影響

取4份5.0g處理備用的干魚鱗，按料液比為1：10經預處理后，加入0.2g中性蛋白酶，調pH6.0，于50℃進行酶解.酶解時間分別為2，2.5，3，3.5小時，測定魚鱗蛋白的水解度以考察酶解時間的影響，結果見圖4。

圖4結果顯示，酶解時間對水解度的影響較小。當水解時間增加，水解度隨之上升，但幅度不大。當酶解時間為3-3.5h時，水解度不再隨反應時間而變化，基本保持不變。推測可能是由于反應時間的增長，水解產物中的某些氨基酸殘基逐步占據了中性蛋白酶的活性部位，產生了競爭抑制作用，致使水解反應無法再繼續進行，故確定3h為最適水解時間水平參考點。

2.5 正交實驗

根據以上單因素實驗結果，以溫度、酶用量、料液比、酶解時間為因素設計4因素3水平正交試驗L9（34），進一步優化酶解工藝條件。

根據表2結果，極差大小的順序為料液比>酶用量>時間>溫度。極差愈大，對結果的影響也越大，因此料液比對酶解的影響遠遠大于其他三者。由此結果可以得出中性蛋白酶酶解魚鱗的最佳水解條件為A1B2C1D2，即酶用量4%，溫度45℃，料液比10%，時間為3h。該條件與文獻報道的結果相比，大大減少了酶解時間，可能是由于適當提高了酶用量以及適當降低了料液比，使得蛋白酶可以與底物更加充分接觸，增加了碰撞的機會，從而加速反應，大大縮短了時間，提高了酶解效率，同時也降低了酶解溫度，較好的控制了苦味肽的釋放。

用上述優化的工藝條件進行確認試驗，做三份平行，最終水解度平均值為28.9%。

2.6 魚鱗蛋白肽分子量分布

將2.5中條件下水解獲得的魚鱗蛋白肽酶解液稀釋5倍，自動進樣，Superdex凝膠柱分離，與標準蛋白對照品比對，檢測分析在該條件下水解所得蛋白肽的分子量分布，結果見圖5和圖6。實線為樣品峰.虛線為蛋白對照品的峰。

凝膠色譜法主要用于高聚物的相對分子質量分級分析以及相對分子質量分布測試，目前已被廣泛用于生物化學、分子生物學、分子免疫學以及醫學等有關領域。魚鱗蛋白基本上是由膠原蛋白和硬蛋白組成，這兩種蛋白均是結構蛋白，分子量都大于300 KDa。

實驗中使用Superdex 200和Superdex pep-tide兩種凝膠柱進行分離分析。前者填料的顆粒較粗，適用于分子量較大的蛋白分離，由圖5可知，魚鱗蛋白經過堿性蛋白酶水解后，大分子量區域呈平直的基線水平，說明原料幾乎全部被分解成10 KDa以下的片段。后者填料顆粒相對較小，從圖6結果可以看出，魚鱗蛋白水解后肽段分子量分布主要集中在第2和第3個峰之間，即1-6Ku范圍內。從譜圖中多肽的分子量分布來看，中性蛋白酶能夠將魚鱗蛋白很好地水解，所得的蛋白肽段的大小比較合適，適合食品及化妝品行業的需求。如果水解度過高，芳香族等疏水基團將暴露出來，會造成苦味肽大量產生。

3 結論

文章采用中性蛋白酶酶解海洋魚鱗蛋白，通過對酶解反應影響因素的單因素考察以及L9（34）正交實驗設計，獲得了優化條件，即溫度45℃、酶用量4%、料液比10%和時間3h。比文獻報道大大縮短了酶解時間，降低了酶解溫度，提高了酶解效率。通過酶解產物分子量分布分析，在上述優化的條件下，中性蛋白酶可以很好地將魚鱗蛋白水解成1-6KDa大小的肽段.適合食品和化妝品行業的需求。

以資源豐富的海洋魚鱗蛋白制備一系列多肽產品具有廣闊的應用領域，橫跨化工業、食品行業、化妝品業、醫藥業等。因此，該系列產品的開發有著美好的前景，可以真正地實現低值資源的“變廢為寶”高值化利用。

參考文獻（略）