泡菜“花變”初期主要細菌的分離與鑒定

左若弘 （南京市第十三中學 江蘇南京 210000）

泡菜以清脆、開胃、滋味爽口著稱，在中國已有大約3000多年的歷史。泡菜是以新鮮蔬菜為原料，利用自身附著的微生物或添加的乳酸菌作為發(fā)酵劑，通過厭氧發(fā)酵所制成的傳統(tǒng)而獨特的發(fā)酵食品。蔬菜表面通常附生有細菌、酵母菌和霉菌等多種微生物，在泡菜的制作過程中乳酸菌最終成為優(yōu)勢菌，其代謝產(chǎn)物和低氧分的環(huán)境抑制了食品腐敗菌的生長，從而保障了食品的品質和風味。

家庭制作泡菜簡單易行，食用方便。但由于泡菜原料未經(jīng)過滅菌處理，因此在后期發(fā)酵過程中一旦環(huán)境溫度升高或者存放條件不利，泡菜中的腐敗微生物就會大量滋生，從而導致產(chǎn)品的腐敗變質。在泡菜品質劣變的眾多顯現(xiàn)中，“生花”是最常見的現(xiàn)象之一。“生花”就是在泡菜表面形成一層白膜，泡菜一旦生花之后，菜品風味發(fā)生不期待的變化（餿臭味或腐敗味），泡菜壇中鹽水表面形成白色成片或成碎花狀的膜，菜品開始軟爛，泡菜水變渾濁，輕者影響風味，重者整壇菜都不能食用。在夏秋季節(jié)由于溫度較高，在家庭制作的泡菜中約90%會出現(xiàn)不同程度的生花現(xiàn)象。

本實驗欲從引起泡菜生花的微生物入手，對其進行分離、回接，從而明確引起泡菜腐敗的主要微生物類群，通過生物防控的方式控制這些腐敗微生物的生長，從而開發(fā)出富含活性益生菌的安全、衛(wèi)生的泡菜產(chǎn)品。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

材料：從筆者家庭制作的泡菜里收集自然發(fā)酵的、存放時間較長，泡菜汁正在變得渾濁但還沒有明顯“生花”的泡菜汁1份。

牛肉蛋白胨培養(yǎng)基、乳酸細菌培養(yǎng)基（MRS培養(yǎng)基）、溶菌酶、蛋白酶K、由生物公司合成的細菌16S rDNA序列擴增引物（R1：5′-CGGTTACCTTGTTAC?GACTT-3′、R2：5′-AGAGTTTGATYMTGGCTCAG-3′）。

儀器：光學顯微鏡、PCR擴增儀、凝膠成像系統(tǒng)。

1.2 實驗方法

1.2.1 泡菜汁中細菌的分離

泡菜汁活化→10倍法稀釋涂布含有0.75%質量分數(shù)為CaCO3的MRS平板→挑起有溶鈣圈的單菌落染色、鏡檢→在37℃固體劃線培養(yǎng)，選出溶鈣圈大、生長速度快的純培養(yǎng)，液體培養(yǎng)選擇產(chǎn)酸速度較快、產(chǎn)酸量大的菌株。

1.2.2 初步鑒定

（1）載玻片固定。在無菌操作條件下，用接種環(huán)挑取少量細菌于干凈的載玻片上涂布均勻，在火焰上加熱以殺死菌種并使其粘附固定。

（2）草酸銨結晶紫染1min，自來水沖洗，去掉浮色。（3）用碘-碘化鉀溶液媒染1 min，傾去多余溶液。（4）用中性脫色劑如乙醇（體積分數(shù)為95%）或丙酮酸脫色30 s，革蘭氏陽性菌不被褪色而呈紫色，革蘭氏陰性菌被褪色而呈無色。

（5）用番紅染液或者沙黃復染30 s，革蘭氏陽性菌仍呈紫色，革蘭氏陰性菌則呈現(xiàn)紅色。革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌即被區(qū)別開。

（6）用光學顯微鏡觀察。

1.2.3 16S rDNA序列擴增

16S rDNA是細菌染色體上編碼16S rRNA相對應的DNA序列，存在于所有細菌染色體基因中。16S rDNA是細菌的系統(tǒng)分類研究中最有用的和最常用的分子鐘，其種類少，含量大（約占細菌RNA含量的80%），分子大小適中，存在于所有的生物中，其進化具有良好的時鐘性質，在結構與功能上具有高度的保守性，素有“細菌化石”之稱。16S rDNA由于大小適中，約1.5 kb，既能體現(xiàn)不同菌屬之間的差異，又能利用測序技術較容易地得到其序列，故被細菌學家和分類學家接受。目前，16S rDNA的序列信息已經(jīng)廣泛應用于菌種鑒定和系統(tǒng)發(fā)生學研究。

（1）DNA提取。挑取單菌落接種于5 mL的MRS液體培養(yǎng)基，37℃厭氧培養(yǎng)48 h，取部分獲得純培養(yǎng)物加15%滅菌甘油-70℃保存菌種，其余培養(yǎng)液置于4℃冰箱靜置2 h后，吸取1.5 mL菌體置于離心管中，8 000 r/min離心5 min，去上清液;沉淀用滅菌生理鹽水洗滌2次，加入200 μL溶菌酶（ 50 mg/mL）混勻，37℃放置2h，8000r/min離心5min，去上清液;沉淀用滅菌生理鹽水洗滌2次，加入200μL溶菌酶（50mg/mL）混勻，37℃放置2 h;加入400 μL 10%SDS 混勻，再加入 5 μL 蛋白酶K（20 mg/mL），55℃水浴1 h;加入650 μL 酚/氯仿/異戊醇（25∶24∶1）抽提，12 000 r/min離心10 min，吸取上清液至1.5 mL離心管中，加入2倍體積的無水乙醇，12 000 r/min離心10 min，沉淀用70%乙醇洗滌一次，室溫吹干后加入25 μL的TE緩沖液溶解，取8 μL DNA提取物用1%的瓊脂糖電泳檢測，其余樣品-20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

（2）菌株16S核糖體DNA的PCR擴增。檢測反應體系為：50 ng/μL DNA 模板3 μL，RS上游引物和下游引物（50 pmol/μL）各2 μL，10 × PCR 緩沖液5 μL，10 mmol/L dNTPs 2 μL，Taq酶1 μL，2 mmol/LMgCl22 μL，ddH2O 33 μL;PCR 擴增程序為94℃預變性4 min，94℃變性1 min;52℃退火1 min;72℃延伸2 min，30個循環(huán);72℃補充延伸10 min后反應結束。每個樣品擴增2次。取10 μL PCR擴增產(chǎn)物和2 μL溴酚藍混合，以70 V電壓在1.5%瓊脂糖上電泳2 h，溴化乙錠染色20 min，用凝膠成像系統(tǒng)拍照并記錄結果。

（3）菌株16S rDNA的測序分析。PCR檢測反應體系中16S rDNA上游引物和下游引物（50 pmol/μL）各2 μL，其余組分同上;PCR擴增程序為94℃預變性4 min，94℃變性1 min;55℃退火45 s;72℃延伸2 min，35個循環(huán);72℃補充延伸10 min后反應結束。取10 μL PCR擴增產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖上電泳檢測條帶大小，其余產(chǎn)物送上海生物工程技術服務有限公司測序分析，序列測定結果登陸NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/），將所得序列與數(shù)據(jù)庫中已知序列進行同源性搜索比對。

2 結果與分析

2.1 菌株培養(yǎng)

細菌分離培養(yǎng)所得菌落較小，直徑0.2~0.5 mm，在培養(yǎng)基上略突起，圓點狀，顯白色偏黃，略透明，邊緣明顯，生長緩慢。

2.2 光學顯微鏡觀察

經(jīng)革蘭氏染色后在40倍油鏡下觀察：菌株經(jīng)革蘭氏染色后呈紅色，可見該菌為革蘭氏陰性菌。形狀為橢圓形，多集中在一起，大小各異，大者比小者大1倍。

2.3 16S rDNA基因PCR產(chǎn)物

采用即用型PCR擴增試劑盒對各菌株提取的基因組DNA進行PCR擴增，電泳結果顯示擴增的DNA片段大小約為1 500 bp。

得到的各菌株16S rDNA基因序列全長1 508 bp。將該序列在NCBI（美國國家生物技術信息中心）網(wǎng)站（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）上進行同源序列搜索，根據(jù)搜索結果，該菌株與解鳥氨酸拉烏爾菌（Raoultella ornithinolytica）B6的全基因組序列的16 S rDNA相似度高，相似度為97%。

3 結論與討論

（1）首次報道了泡菜“花變”初期大量存在解鳥氨酸拉烏爾菌，并首次對其進行了形態(tài)觀察。由于對其的繁殖方式未做研究，電鏡觀察到的該細菌不為二分裂繁殖，L型菌體似出芽繁殖，這有待進一步研究。

（2）細菌的鑒定方法。細菌的鑒定方法可以依靠直接形態(tài)觀察和生理生化特征分析方法，但這兩種方法不但耗時費力而且獲取的信息也比較有限，而挑取代表菌株進行16S rDNA測序鑒定，可以快速準確地鑒定分析菌株。在以后的細菌鑒定研究中可以優(yōu)先選擇采用。

（3）解鳥氨酸拉烏爾菌為好氧菌，因此在泡菜花變初期，泡菜水開始渾濁之時，注意只要將泡菜水上方的氧氣去掉，那么水體表面的雜菌就很難生存了。如何去氧就要看你的實際情況了。買一份除氧劑，想辦法將其安置到泡菜壇里即可。民間的辦法是用鐵，鐵易被氧化，將干凈鐵塊直接投入泡菜水可以除氧，將鐵粉或碎鐵包好粘附在泡菜壇蓋內頂，能除空氣中的氧。但是，用鐵有個不好就是吸氧后產(chǎn)生鐵銹。因此，將鐵塊投入水內的做法只用來清除白花，清除完畢就要取出來。