木瓜濾渣微波輔助提取木瓜多糖的響應(yīng)面法工藝優(yōu)化及其抗氧化活性研究

張彥慧，李彥霏，胡仲秋

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院，北京 100083）

0 引言

木瓜，我國獨(dú)特的古老果樹之一，產(chǎn)量極高，僅云南省的木瓜年產(chǎn)量就可達(dá)500×104kg[1]。同時，木瓜有極高的藥用價值和營養(yǎng)價值[2]，研究表明，木瓜富含維生素、天然植物“多糖”、礦物質(zhì)、蛋白質(zhì)等，俗語有“杏一益，梨二益，木瓜百益”之稱[2-4]。多糖為木瓜的主要活性成分之一，含量豐富[5-6]，作為一種重要的生物活性物質(zhì)，木瓜多糖不僅能調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫能力[6-8]，而且具有抗腫瘤、抗氧化[9]、抗感染、抗病毒等多種生物功能[10-14]。而人類機(jī)體內(nèi)氧自由基占總自由基的95%以上，對機(jī)體細(xì)胞和組織有嚴(yán)重?fù)p傷作用，是引發(fā)人體衰老的主要原因[15]，適量補(bǔ)充抗氧化物質(zhì)則能延緩上述情況的發(fā)生。近年來，高抗氧化活性物質(zhì)的開發(fā)利用受到大眾廣泛重視，也是當(dāng)今社會對植物資源利用的新趨勢[16]。

微波輔助提取技術(shù)已被廣泛用于植物有效活性成分的提取，在提取過程中，既保證有效成分的充分溶出，又可防止提取物降解，對于某些物質(zhì)的提取效果明顯優(yōu)于其他方法[17]。響應(yīng)曲面法（Response Surface Methodology，RSM） 主要用于多變量研究[18]，目前，將響應(yīng)面法用于優(yōu)化微波輔助提取木瓜多糖工藝鮮有報道。試驗(yàn)以提取過綠原酸的木瓜濾渣為原料，采用微波輔助熱水提取法提取木瓜多糖，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上應(yīng)用響應(yīng)面分析法對提取工藝影響較大的4個因素即料液比、水浴溫度、微波時間、提取時間進(jìn)行優(yōu)化，獲得微波輔助熱水提取木瓜多糖的最佳工藝條件。采用DPPH法和Fenton反應(yīng)[19]考查上述方法所提取木瓜多糖的體外抗氧化[20]活性，旨在為木瓜的產(chǎn)業(yè)化綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

木瓜，陜西凱興中藥飲片有限公司提供，采用經(jīng)粉碎，提取綠原酸后獲得木瓜濾渣；葡萄糖、水楊酸，天津市登峰化學(xué)試劑廠提供；正丁醇、氯仿，天津市博迪化工有限公司提供；重蒸酚，北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供；濃硫酸、無水乙醇，西安三浦精細(xì)化工廠提供；蒸餾水，西北農(nóng)林科技大學(xué)提供；硫酸亞鐵、氫氧化鈉，西安化學(xué)試劑廠提供；30%過氧化氫（雙氧水），上海麥克林生化科技有限公司提供；石油醚、乙醚，天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司提供；DPPH（二苯基苦味?；诫?、1,1-dipheny,1-2-picrylhydrazyl）。

1.2 儀器與設(shè)備

MP200B型電子天平，上海精科天平雙圈牌產(chǎn)品；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司產(chǎn)品；SHB-III型循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司產(chǎn)品；P7021TP-6型格蘭仕微波爐，上海隆譽(yù)微波設(shè)備有限公司產(chǎn)品；B-490S型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士Buchi公司產(chǎn)品；PK121R型離心機(jī)、UV-2550型紫外分光光度計、UV-1700型紫外可見分光光度計（波長范圍190.0～990.0 nm）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

稱取無水葡萄糖制得葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)溶液，依次取上述標(biāo)準(zhǔn)液 0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mL，置于8個10 mL帶刻度的試管中，加蒸餾水分別補(bǔ)至2 mL。每個試管均加入1.0 mL苯酚溶液（5%，4℃），搖勻，加入濃硫酸7.0 mL，于50℃的水浴鍋中保溫40 min后取出。將所有溶液迅速冷卻到室溫，以第一濃度作為空白，按照分光光度法于波長490 nm處（掃描確定的最佳波長）測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 木瓜多糖的提取及測定

準(zhǔn)確稱取提取綠原酸后的木瓜濾渣粉末0.5 g，加入一定比例的蒸餾水，在500 W功率下使用微波輔助提取一定時間，并以一定溫度水浴一定時間后，抽濾并離心，吸取上清液，加Sevag試劑（正丁醇∶氯仿=1∶5（V∶V））去蛋白，上層溶液稀釋100倍，苯酚硫酸法比色。

取稀釋1 000倍的多糖提取液于分光光度計中，以空白試樣用作參比依次測定吸光度，記錄樣品的吸光度。根據(jù)樣品的吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求取其濃度。提取量計算如下：

式中：Y——多糖提取量，mg/g；

C——由吸光度測得質(zhì)量濃度，mg/L；

V——定容體積，mL；

m——木瓜濾渣的質(zhì)量，g；

f——換算因子f=1.567[21]。

1.3.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計

按照1.3.1微波提取方法的步驟，準(zhǔn)確稱取0.5 g濾渣，研究純化水-干燥濾渣（即料液比）、微波時間、水浴溫度和水浴時間4個因素對木瓜水溶性多糖提取量的影響。①固定微波功率500 W，提取時間30 s，在80℃的水浴溫度下提取60 min，考查不同的料液比 1∶20，1∶30，1∶40，1∶50（g∶mL）對提取量（mg/g） 的影響。固定料液比1∶40（g∶mL），微波功率500 W，在80℃水浴溫度下提取多糖60 min，考查微波時間分別為10，20，30，40 s時對提取量的影響。②固定料液比1∶40（g∶mL），微波功率500 W，微波時間20 s，水浴提取多糖60 min，考查水浴溫度依次為60，70，80，90℃時對提取量的影響。③固定料液比1∶40（g∶mL），微波功率500 W，微波輔助提取20 s，在80℃水浴下考查提取時間45，60，75，90 min對試驗(yàn)結(jié)果的影響。

1.3.4 Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計

以單因素試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，每個因素選擇3個影響較大的水平，以木瓜多糖提取量為響應(yīng)值，建立四因素三水平中心組合試驗(yàn)，各因素3個水平采用-1，0，1進(jìn)行編碼。

微波法提取木瓜多糖因素與水平設(shè)計見表1。

表1 微波法提取木瓜多糖因素與水平設(shè)計

1.3.5 木瓜多糖的抗氧化性試驗(yàn)

稱取適量優(yōu)化工藝條件下得到的木瓜多糖，配制稀釋成4，5，6，7，8倍的多糖溶液，進(jìn)行其抗氧化活性試驗(yàn)研究。

（1） DPPH·清除率的測定。配制DPPH·標(biāo)準(zhǔn)液（6.5×10-4mol/L），于100 mL容量瓶中稀釋10倍，定容待測。參照Chen Y T等人[22]對生姜成分的抗氧化活性研究中的操作方法，定量移取多糖溶液、50%乙醇溶液和DPPH·；另取一支試管加入1 mL 50%乙醇溶液和4 mL DPPH·10倍稀釋液作為空白組進(jìn)行對照。以上所配樣品置于暗處靜置20 min，離心10 min（轉(zhuǎn)速3 000 r/min），于波長517 nm處測定吸光度。

樣品 DPPH·（Scavenging activity，SA） 的清除公式可表示為：

式中：Ai——樣液反應(yīng)后吸光度；

Aj——溶劑混合液、DPPH·混合吸光度；

Ao——樣液、溶劑混合液混合吸光度。

（2） 羥基自由基消除能力測定。參照Chen Y T等人[22]對生姜成分的抗氧化活性研究中的操作方法，分別配制含有定量FeSO4溶液、水楊酸-乙醇溶液（9 mmol/L） 和 H2O2溶液（8.8 mmol/L） 的試樣，依次加入上述一定倍數(shù)的提取液，于37℃下恒溫水浴反應(yīng)30 min，于波長510 nm處測定樣品吸光度。

·OH清除率公式為：

式中：A′i——加提取液后吸光度，

A′j——不加顯色劑的提取液本底吸光度，

A′o——對照液吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

2.1.1 葡萄糖波長的掃描

從1.3.1步驟中任選3個濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以400～900 nm的波長范圍，在分光光度計上進(jìn)行波長掃描。

3個不同葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液在400～900 nm波長下掃描波長圖譜見圖1。

由圖1發(fā)現(xiàn)除去儀器的波動，大部分樣品都在波長490 nm左右有明顯的最大吸收峰，因此得出葡萄糖溶液的最大吸收波長為490 nm。故選取490 nm為該試驗(yàn)分光光法的檢測波長。

2.1.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

由1.3.2測定步驟測得標(biāo)準(zhǔn)吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

由圖2可知，在該試驗(yàn)和儀器條件下吸光度和質(zhì)量濃度的關(guān)系為Y=0.055 04X+0.008 66，R2=0.995 51（Y為吸光度；X為標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度，mg/L）。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 料液比對木瓜多糖提取量的影響

不同料液比對木瓜多糖提取量的影響見圖3。

由圖3可知，通過不同料液比的木瓜多糖提取量對比可以發(fā)現(xiàn)，料液比為1∶20～1∶40時提取量逐漸升高，這和陳毅挺等人對翻白草的提取工藝研究中，料液比對試驗(yàn)結(jié)果影響的增長趨勢一致，說明較多的溶劑利于木瓜中多糖的析出，但當(dāng)料液比超過1∶40時多糖的提取量有所下降，故選擇料液比為1∶40。

2.2.2 微波時間對木瓜多糖提取量的影響

不同微波時間對木瓜多糖提取量的影響見圖4。

由圖4可知，微波時間為10～20 s木瓜多糖提取量迅速提高，20 s后開始降低。說明在一定時間內(nèi)微波時間加長可以使木瓜多糖的提取量迅速升高，但是到了一定的時間后其提取量就會達(dá)到飽和，并可能使原料中的多糖發(fā)生分解，導(dǎo)致多糖提取量降低，這與王安良等人[23]在優(yōu)化山藥中多糖的微波提取工藝研究中，微波時間對多糖提取量的影響是一致的。微波法作為一種輔助提取方法，由于其會使溫度在短時間迅速上升，部分多糖分解而造成損失，綜合考慮提取量、提取成本等因素，初步確定微波處理時間為20 s。

2.2.3 水浴時間對木瓜多糖提取量的影響

不同水浴時間對木瓜多糖提取量的影響見圖5。

由圖5可知，水浴時間分別為45，60，75，90 min時，木瓜多糖提取量前段時間先增加，時間較長后減小。分析原因可能是提取時間短時，提取物的溶解不充分，而提取時間過長時，則會引起提取成分分解，造成提取產(chǎn)量的下降。如陳小梅等人[24]在提取滸苔多糖時，也出現(xiàn)了相同的現(xiàn)象。4個水平中多糖提取量最高值在45 min時出現(xiàn)，因此選取45 min作為參考水浴時間。

2.2.4 水浴溫度對木瓜多糖提取量的影響

不同水浴溫度對木瓜多糖提取量的影響見圖6。

由圖6可知，當(dāng)水浴溫度分別為60～90℃時，木瓜多糖提取量先增加后減小，在80℃之前變化明顯，60～80℃為上升階段，增勢較陡，從80℃后降低，說明在一定的溫度下，提取溫度的增加可以使木瓜多糖提取量增加，但是到達(dá)一定的溫度時，提取溫度升高不會使提取量增加，可能由于隨著溫度的升高，木瓜多糖結(jié)構(gòu)隨之遭到破壞，活性喪失，導(dǎo)致提取率下降。這與付瑞敏等人[25]在響應(yīng)面分析法優(yōu)化野木瓜多糖提取工藝中，提取溫度對提取量的影響一致，故在4個水平中，選擇80℃為水浴提取溫度。

2.3 微波法提取木瓜多糖的響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化設(shè)計的試驗(yàn)結(jié)果

微波法提取木瓜多糖時微波時間（B）、水浴時間（C）、水浴溫度（D） 和料液比（A） 對多糖產(chǎn)量的響應(yīng)結(jié)果如下表8所示。

響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果

利用二次多項(xiàng)式擬合后，得到回歸方程：

回歸模型方差分析見表3。

由表3可知，一次項(xiàng)、二次項(xiàng)及交互項(xiàng)對試驗(yàn)結(jié)果的影響顯著性不高。但失擬項(xiàng)檢驗(yàn)不顯著（p＞0.05)，說明回歸方程與試驗(yàn)結(jié)果擬合較好，模型方程還是具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。在該試驗(yàn)范圍內(nèi)，最優(yōu)的提取工藝為料液比1∶40（g∶mL），500 W微波處理30 s，然后在90℃下水浴提取60 min。經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)驗(yàn)證后，模型方程的預(yù)測結(jié)果與實(shí)際試驗(yàn)結(jié)果吻合度較高。比相同條件下傳統(tǒng)水浴法的木瓜多糖平均提取量（50.33±2.06 mg/g） 高出約10.5%。李容等人[26]研究木瓜多糖的提取及醇沉工藝中，木瓜多糖的提取率僅有50 mg/g（5%），對比可知微波法輔助提取有更好的提取率。

表3 回歸模型方差分析

2.4 抗氧化活性

2.4.1 DPPH·清除率測定

通過抗氧化性物質(zhì)與DPPH·單電子的配對，使其醇溶液顏色變化，于波長517 nm處的吸收消失，評價清除物質(zhì)的清除能力。

木瓜多糖對DPPH·的清除作用見圖7。

由圖7可知，木瓜多糖對DPPH·的清除作用結(jié)果顯示，隨著反應(yīng)體系中木瓜多糖溶液質(zhì)量濃度的提高，清除率逐漸升高，木瓜多糖清除DPPH·自由基的能力增強(qiáng)，清除效力與質(zhì)量濃度有良好的量效關(guān)系，而且其關(guān)系以二次多項(xiàng)式擬合最好，清除率與木瓜多糖質(zhì)量濃度的關(guān)系：

Y=0.857 1X2+6.177 1X-3.82，R2=0.996 4（Y為清除率，%；X為木瓜多糖質(zhì)量濃度，mg/mL）。

由于高質(zhì)量濃度的木瓜多糖含有的抗氧化功能集團(tuán)（羥基、酚羥基）多于低質(zhì)量濃度的木瓜多糖，這些羥基、酚羥基是抗氧化的主要功能團(tuán)，針對清除DPPH·活性的動力學(xué)反應(yīng)性質(zhì)，馮學(xué)珍等人[27]利用網(wǎng)地藻多糖展開了研究，通過3種濃度的二級反應(yīng)常數(shù)對比發(fā)現(xiàn)，隨著多糖反應(yīng)濃度逐漸升高，其清除DPPH·的速度越來越快，清除自由基能力也越來越強(qiáng)，因此試驗(yàn)中木瓜多糖質(zhì)量濃度越高，則DPPH·的清除能力越強(qiáng)。

試驗(yàn)結(jié)果表明，上述提取法能夠有效地保持木瓜多糖的抗氧化活性。

2.4.2·OH清除率測定

據(jù)現(xiàn)代研究表明，·OH是機(jī)體內(nèi)毒性最強(qiáng)的活性氧自由基，其壽命短、反應(yīng)性強(qiáng)，是導(dǎo)致生物有機(jī)體過氧化損傷的主要原因。·OH可以引起組織病變，從而導(dǎo)致疾病發(fā)生、加速生物機(jī)體衰老。若通過攝入適量外源性清除食物，可有效預(yù)防這些情況的發(fā)生。利用Fenton反應(yīng)可以有效檢測多糖清除自由基的能力，H2O2和Fe2+混合時，生成高活性的·OH，水楊酸結(jié)合生成有色物質(zhì)。向該反應(yīng)體系中加入有清除作用的物質(zhì)時，優(yōu)先結(jié)合·OH，使水楊酸結(jié)合的自由基數(shù)量減少，從而減少有色物質(zhì)，于510 nm波長下測定吸光度確定·OH剩余含量即可判斷清除能力。

試驗(yàn)中所提取木瓜多糖中含有豐富的生物多糖，其與水楊酸形成清除·OH的競爭反應(yīng)。

木瓜多糖對·OH的清除作用見圖8。

由圖8可知，當(dāng)木瓜多糖質(zhì)量濃度為1.2 mg/mL時，·OH清除率為2.9%，隨木瓜多糖質(zhì)量濃度增加，當(dāng)達(dá)到2.8 mg/mL時，清除能力高達(dá)47.9%左右，木瓜多糖（APS）對·OH的清除能力呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系，清除率與多糖質(zhì)量濃度的關(guān)系Y=0.857 1X2+6.177 1X-3.82，R2=0.989 8（Y為清除率，%；X為木瓜多糖質(zhì)量濃度，mg/mL），呈二次函數(shù)遞增趨勢，說明在一定范圍內(nèi)，木瓜多糖具有較強(qiáng)的清除·OH能力，同時表明該方法提取的木瓜多糖能夠保持很好的抗氧化活性。

3 結(jié)論

采用響應(yīng)面法優(yōu)化了木瓜多糖的提取工藝，利用微波輔助提取法從木瓜濾渣中提取木瓜多糖構(gòu)建了提取的回歸模型，獲得優(yōu)化后的提取條件為料液比1∶40，微波時間30 s，水浴溫度90℃，水浴時間60 min。以提取過綠原酸的光皮木瓜濾渣為原料，3次重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)微波輔助提取木瓜多糖的平均提取率可達(dá)60.83±2.09 mg/g。比相同條件下傳統(tǒng)水浴法的木瓜多糖平均提取率（50.33±2.06 mg/g） 高出約10.5%，優(yōu)于前人的研究成果。由此可知，微波輔助提取具有更優(yōu)的提取效果。

分別利用DPPH·，·OH 2種方法對提取的光皮木瓜多糖進(jìn)行了抗氧化試驗(yàn)，經(jīng)過結(jié)果對比分析，發(fā)現(xiàn)該方法提取的木瓜多糖對DPPH·和·OH均具有良好的清除能力，抗氧化性與溶液質(zhì)量濃度有顯著的量效關(guān)系，隨質(zhì)量濃度增大而增大，這表明該方法提取的木瓜多糖能夠保持較好的抗氧化活性，為木瓜的產(chǎn)業(yè)化綜合利用提供理論依據(jù)。

同時，由于機(jī)體自由基中危害極大的·OH，可引起細(xì)胞的死亡、機(jī)體衰老等危害，亟待開發(fā)有抗氧化和清除·OH作用的天然物質(zhì)。木瓜多糖作為一種取自木瓜的天然抗氧化性物質(zhì)，既無毒害，又無劑量限制，未來研究中可以作為·OH的強(qiáng)清除劑，同時，木瓜中豐富的功能活性成分在功能性食品方面顯有著廣闊的開發(fā)前景。