響應曲面法優化菠蘿皮渣多糖的提取及其抗氧化活性研究

杭瑜瑜，秦紫瓊，楊 波

（海南熱帶海洋學院生命科學與生態學院，海南三亞 572022）

0 引言

多糖具有調節免疫[1-2]、抗氧化[3-4]、抗突變[5]、抗腫瘤[6]、降血脂[7]、血糖[8]等多種生理活性，具有良好的應用前景。其提取方法有熱水浸提法、酸提法、減提法、超聲輔助提取法、微波輔助提取法和酶解法等。熱水浸提法不需特殊設備，成本低。菠蘿生產過程中，大量菠蘿皮渣是菠蘿生產和加工的主要副產品，占全部水果質量的50%～60%[9]。相關研究表明，菠蘿皮渣與菠蘿果實中營養成分的種類與比例相差不多。在全球范圍內，雖然一些研究是針對菠蘿皮渣開發與利用的，但是研究成果應用的效果并不是很理想[10]。為了菠蘿皮渣這一加工副產物可以被人們充分利用，試驗以菠蘿皮渣為原料提取菠蘿皮渣中的多糖，并研究其抗氧化活性，可以提高菠蘿皮渣廢棄物的利用率，并增加植物多糖的來源途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗材料與試劑

菠蘿皮渣：從市場收集新鮮菠蘿皮渣，預處理后備用。

葡萄糖、無水乙醇、苯酚、濃硫酸、硫酸亞鐵、雙氧水、水楊酸、鄰苯三酚、濃鹽酸等，均為分析純。

1.1.2 主要試驗儀器

ML-T型分析天平，梅特勒-托利多國際貿易（上海）有限公司產品；800型電動離心機，金壇市江南儀器廠產品；752N型紫外可見分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司產品；101-1AB型電熱鼓風干燥箱，天津賽得利斯實驗分析儀器廠產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 菠蘿皮渣中多糖的提取

選取新鮮的菠蘿皮渣，用清水洗干凈后，瀝干水分。將其放入60℃干燥箱干燥12 h，并進行翻動，達到恒質量后將其粉碎，過60目篩，置于玻璃容器中密封保存，備用。稱取適量菠蘿皮渣，調整料液比1∶10，在溫度50℃水浴下處理20 min，待提取液冷卻后抽濾，以轉速4 500 r/min對濾液離心10 min，上清液蒸發濃縮至原體積的1/4，加入4倍體積95%的乙醇溶液，于室溫下醇沉12 h，以轉速4 500 r/min沉淀離心20 min后取出，在50℃真空干燥箱干燥24 h，得到菠蘿皮渣粗多糖，稱質量。

1.2.2 菠蘿皮渣多糖含量的測定方法

（1）菠蘿皮渣多糖最大吸收波長確定。配制葡萄糖標準溶液，采用硫酸-苯酚法顯色法使葡萄糖標準溶液顯色，再使用紫外-可見分光光度計，于波長190～700 nm處進行光譜掃描，確定最大吸收波長。提取到的菠蘿皮渣多糖也按相同的方法測定，確定最大吸收光譜。

（2） 葡萄糖標準溶液的配制及標準曲線繪制。精確稱取葡萄糖標準品4 mg，溶解于燒杯之中，轉移至50 mL容量瓶中，定容。逐步稀釋后依次得到質量濃度為40.0，20.0，10.0，5.0，2.5 mg/L的葡萄糖溶液。各取2 mL溶液與比色管中，分別加入1 mL質量分數為6%的苯酚水溶液，迅速搖勻，接著立刻加入5 mL濃硫酸，溶液顯色后放入冷水中冷卻[11]，冷卻后，使用分光光度計在最大吸收波長處依次測得不同質量濃度葡萄糖標準溶液的吸光度，記錄數據，并標準曲線。得到標準曲線方程為：Y=0.011 5X+0.078 3，R2=0.997 5。

（3）菠蘿皮渣多糖含量的計算。將提取到的菠蘿皮渣多糖溶解于燒杯中，轉移至50 mL容量瓶中，定容后搖勻。按照1.2.2（2）中的顯色方法，于最大吸收波長處測定菠蘿皮渣多糖的吸光度。通過標準曲線公式進行計算，得到所提取的菠蘿皮渣多糖的含量。

（4）菠蘿皮渣多糖提取率的計算。

1.2.3 菠蘿皮渣多糖提取的單因素試驗

分別研究提取溫度、料液比和提取時間對多糖提取率的影響。提取溫度選取50，60，70，80，90℃；料液比選取 1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30；提取時間選取20，30，40，50，60 min。

1.2.4 菠蘿皮渣多糖提取的響應曲面優化

依據單因素試驗結果，設計響應曲面試驗。

因素與水平設計見表1。

表1 因素與水平設計

1.2.5 菠蘿皮渣多糖的體外抗氧化活性研究

（1）清除羥自由基活性的測定。參考楊江濤等人[12]的方法進行測定。

（2）清除超氧陰離子活性的測定。參考徐建國等人[13]的方法進行測定。

2 結果與分析

2.1 菠蘿皮渣多糖的吸收光譜圖

按照1.2.2（1）的方法，葡萄糖標準品和菠蘿皮渣多糖的光譜掃描圖。

葡萄糖標準品的光譜掃描圖見圖1，菠蘿皮渣多糖樣品的光譜掃描圖見圖2。

從圖中可以看出，葡萄糖標準品于波長489 nm處有最大吸收峰，菠蘿皮渣多糖樣品在相同的波長處有最大吸收。因此，所提取的樣品為多糖。

2.2 單因素試驗結果與分析

2.2.1 提取溫度對菠蘿皮渣多糖提取率的影響

在料液比1∶15，提取時間20 min的條件下，研究不同的提取溫度對菠蘿皮渣多糖提取率的影響。

提取溫度對菠蘿皮渣多糖提取率的影響見圖3。

由圖1可知，當提取溫度低于80℃時，隨著提取溫度的不斷升高，多糖的提取率不斷增大；當提取溫度高于80℃后，隨著提取溫度的不斷升高，多糖提取率開始呈下降趨勢，因此選擇提取溫度80℃較為適宜。

2.麻雀雖小，五臟俱全，對聯堪稱微作文。要想寫得像，必須按照對聯特點去寫，“拓展成上句，對應得下聯”，是為入門法。要想寫得好，必須是“有感而發，言簡意賅，能耐人尋味。”因為，對聯也是情感與智慧的結晶。

2.2.2 料液比對菠蘿皮渣多糖提取率的影響

當提取溫度80℃，提取時間20 min的條件下，研究不同料液比對菠蘿皮渣多糖提取率的影響。

料液比對菠蘿皮渣多糖提取率的影響見圖4。

由圖4可知，隨著浸提液料液比的增大，多糖的提取率先迅速升高，然后又呈現平緩增加趨勢。提取液料液比增大，反應較完全，多糖的擴散速度增快，提取率有所升高；但提取液料液比過大，會給后續工藝增加難度，并且造成試劑浪費。因此，選擇料液比1∶15較為合適。

2.2.3 提取時間對菠蘿皮渣多糖提取率的影響

在提取溫度80℃，料液比1∶15的條件下，研究不同的提取時間對菠蘿皮渣多糖提取率的影響。

提取時間對菠蘿皮渣多糖提取率的影響見圖5。

由圖5可知，菠蘿皮渣多糖提取率隨著提取時間的延長不斷提高，但在30 min之內增長迅速，30 min之后，提取率增長緩慢，變化較小，選擇提取時間30 min較為合適。

2.3 響應曲面試驗結果與分析

響應曲面試驗設計與結果見表2，回歸模型方差分析見表3。

表2 響應曲面試驗設計與結果

表3 回歸模型方差分析

根據表3的方差分析結果可知，該模型顯著程度極高（p＜0.000 1）。該模型的校正決定系數R2Adj=0.991 0，說明99.10%響應值的變化可以用該的模型來解釋，僅僅大約1%不能用這個模型來解釋。因此，用該模型分析熱水浸提法對菠蘿皮渣多糖的提取條件的優化研究是非常適宜的。3個單因素對菠蘿皮渣中多糖提取率的影響程度依次為料液比＞提取溫度＞提取時間。

根據數學回歸模型得到的數據可以分析出，優化得到的提取菠蘿皮渣多糖的最佳的提取工藝條件為提取溫度86℃，料液比1∶20，提取時間20 min，在此條件下進行驗證性試驗，菠蘿皮渣多糖的提取率為1.590 3%。

2.4 菠蘿皮渣多糖的體外抗氧化活性測定結果

2.4.1 清除羥自由基活性的測定結果

當菠蘿皮渣多糖質量濃度為9.1 mg/L時，其對羥自由基的清除作用達31.62%；當質量濃度達到18.21 mg/L時，其對羥自由基的清除作用達到36.75%。隨著菠蘿皮渣多糖質量濃度的逐漸增高，菠蘿皮渣多糖對羥自由基的清除能力也逐漸增強，由此可以分析出二者之間具有一定的劑量效應關系[14]。

2.4.2 清除超氧陰離子活性的測定結果

當菠蘿皮渣多糖的質量濃度為9.1 mg/L時，對超氧陰離子的清除作用達27.27%；當質量濃度達到36.42 mg/L時，對超氧陰離子的清除作用達到45.45%；當質量濃度達到72.83 mg/L時，菠蘿皮渣多糖對超氧陰離子的清除作用可達到50%以上。超氧陰離子可以被菠蘿皮渣多糖快速、有效地清除掉，其清除能力很強。并且其清除能力隨著菠蘿皮渣多糖質量濃度的升高而增強，由此可以分析出二者之間的劑量效應關系較好。

3 結論

熱水浸提法提取菠蘿皮渣中多糖的工藝條件為提取溫度86℃，料液比1∶20，提取時間20 min，在此條件下進行驗證性試驗，多糖的提取率為1.590 3%。所提取的多糖具有較好的體外抗氧化活性。