不規(guī)則趨化因子在急性肺栓塞后的表達(dá)及機(jī)制研究

謝小娜，蔡學(xué)定

(1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬溫州中醫(yī)院呼吸內(nèi)科，浙江溫州 325000；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，浙江溫州325000)

急性肺栓塞(acute pulmonary embolism，APE)后引起嚴(yán)重的肺損傷和急性肺動(dòng)脈高壓(pulmonary hypertension,PAH)是導(dǎo)致死亡的直接原因。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，APE后形成的PAH與肺動(dòng)脈的機(jī)械阻塞作用密切相關(guān)[1]，甚至認(rèn)為肺栓塞后血栓的機(jī)械阻塞是導(dǎo)致PAH的直接原因。近年來隨著研究的深入還發(fā)現(xiàn)，肺動(dòng)脈機(jī)械阻塞嚴(yán)重程度與肺動(dòng)脈壓力的增高有時(shí)不成正相關(guān)，當(dāng)機(jī)械性阻塞基本解除后，仍發(fā)現(xiàn)肺動(dòng)脈壓力持續(xù)升高的現(xiàn)象。此外，有研究結(jié)果顯示，APE時(shí)大量炎癥細(xì)胞聚集浸潤(rùn)在栓塞血管的周圍，這些聚集稍微炎癥細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子進(jìn)一步加重肺血管內(nèi)皮損傷，因此，這些細(xì)胞因子在APE性PAH的形成中扮演重要的角色[2]。其中，不規(guī)則趨化因子(fractalkine，F(xiàn)KN)又名趨化因子CX3CLl，是趨化因子CX3C亞族的獨(dú)有成員，具有可溶和膜結(jié)合兩種形式，既有趨化性蛋白的功能也有細(xì)胞黏附分子的功能，還具有促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增殖的生長(zhǎng)因子作用[3]。PERROS等[4]在PAH模型中發(fā)現(xiàn)，肺動(dòng)脈病變周圍的炎癥細(xì)胞中FKN表達(dá)增加且在血管平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)也明顯增加。本文研究大鼠APE后FKN的表達(dá)變化及其機(jī)制，從而探討肺栓塞后炎癥反應(yīng)的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 (1)動(dòng)物：SPF級(jí)健康雄性SD大鼠72只，體質(zhì)量300～350 g，由溫州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心生產(chǎn)提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證為SCXK(浙)2005-0019。動(dòng)物置于相同環(huán)境和條件飼養(yǎng)。(2)試劑與儀器：BCA 蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司；DAB顯色試劑盒購(gòu)自福建邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司(MXB Biotechnologies)；兔抗大鼠磷酸化p38抗體、兔抗大鼠總P38抗體和山羊抗兔HRP二抗購(gòu)自美國(guó)CST(Cell Signaling Technology)公司；兔抗大鼠FKN抗體購(gòu)自美國(guó)Biolegend公司。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 按照完全隨機(jī)的方法將72只SD大鼠分為對(duì)照組、溶劑組、APE組，每組24只；再將每組分為處理后1、4、8 h 3個(gè)亞組，每組8只。

1.2.2APE大鼠模型建立 (1)自體血栓制備:取聚維酮碘棉球?qū)Υ笫箢i部進(jìn)行消毒，內(nèi)徑1.1 mm頭皮針(19G)置入左頸動(dòng)脈取血并靜置10 min凝血，再將血塊置于37 ℃水中20 min，切成統(tǒng)一規(guī)格1.1 mm×3.0 mm的栓子，并用無菌生理鹽水輕柔沖洗3 遍，放入對(duì)應(yīng)試管內(nèi)，加無菌生理鹽水2 mL，4 ℃冷藏備用，所有操作均為無菌操作。(2) APE模型的建立：使用5%水合氯醛(3 mg/kg)經(jīng)腹腔注射麻醉大鼠，暴露頸正中線并行縱行切口，分離大鼠頸外靜脈并剪一小口，插入19G聚乙烯導(dǎo)管，通過導(dǎo)管注入之前準(zhǔn)備的栓子約50個(gè)(不致大鼠死亡)，附以無菌生理鹽水0.6 mL(0.1 mL/min)，血栓伴隨循環(huán)血液匯聚并嵌頓于肺動(dòng)脈，行核素掃描檢測(cè)發(fā)現(xiàn)栓塞部位核素?cái)z取量明顯減少，證明APE大鼠模型建立成功。對(duì)照組不作任何處理；溶劑組大鼠除注入等量的生理鹽水外,余操作同APE組。在成功建立APE模型后，分別于1、4、8 h 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死大鼠，經(jīng)胸腔取大鼠肺組織。

1.2.3免疫組織化學(xué)(IHC)檢測(cè) 摘取大鼠左肺上葉組織，固定于4%多聚甲醛液24 h，經(jīng)漂洗、脫水、透明、浸蠟、和包埋后再行切片，通過IHC檢測(cè)FKN、p38蛋白的表達(dá)。組織切片經(jīng)脫蠟、水化、封閉及微波修復(fù)后，滴加抗FKN抗體(1∶50)或抗p38抗體(1∶50)于4 ℃過夜后，加入山羊抗兔二抗(1∶50)，DAB顯色終止后行蘇木素復(fù)染，最終脫水、透明中性樹膠封片。置于顯微鏡下觀察p38、FKN在肺組織中的表達(dá)。

1.2.4Western blot檢測(cè)p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinases，p38MAPK)表達(dá) 稱取各組大鼠等量新鮮肺組織加入細(xì)胞裂解液后充分研磨，再經(jīng)超聲細(xì)胞粉碎儀充分破碎，于低溫超速離心機(jī)12 000 r/min 4 ℃離心 10 min，取上清液加入等體積2×上樣緩沖液及相應(yīng)體積PBS充分震蕩混勻并分裝至PCR管經(jīng)PCR儀維持99 ℃運(yùn)行5 min，多余蛋白于-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩＿M(jìn)行10 mol/L SDS-PAGE(電壓濃縮膠80 V，分離膠120 V)蛋白電泳，電泳后將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜(轉(zhuǎn)膜電流300 mA，30 min)后用5 g/L 脫脂奶粉在室溫下封閉1 h，分別加入5%牛血清清蛋白(BSA)稀釋的磷酸化p38單克隆抗體(1∶1 000，兔抗大鼠)和總p38單克隆抗體(1∶1 000，兔抗大鼠) 4 ℃冰箱孵育過夜后，用TBST充分洗滌條帶3 min后，室溫下孵育標(biāo)記辣根過氧化物酶(HRP)的羊抗兔二抗(1∶2 000)1 h，再次用TBST充分洗滌3 min，使用ECL試劑顯色及暗室內(nèi)膠片曝光。使用圖像分析系統(tǒng)對(duì)所得條帶進(jìn)行掃描保存及灰度分析。

1.2.5RT-PCR檢測(cè)FKN mRNA表達(dá) 使用Trizol試劑盒提取肺組織總RNA并測(cè)出A值，A260 nm/A280 nm為1.8～2.0。用日本TakaRa 公司RT-PCR 試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增，逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增條件:65 ℃ 1 min,30 ℃ 5 min,65 ℃ 15 min,98 ℃ 5 min,5 ℃ 5 min,轉(zhuǎn)錄成cDNA后，各組取5 μL加入PCR反應(yīng)體系，PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 1 min，56.2 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，循環(huán)30次。各組PCR產(chǎn)物等量注入2 %瓊脂糖凝膠孔中行水平電泳并在紫外凝膠成像系統(tǒng)下觀察、攝像，隨后進(jìn)行吸光度值(OD)分析。各樣本的基因表達(dá)量計(jì)算方法為產(chǎn)物膠上條帶OD與β-action基因條帶OD的比值。

2 結(jié) 果

2.1APE大鼠FKN的表達(dá)部位 IHC檢測(cè)結(jié)果顯示，F(xiàn)KN在APE大鼠的肺實(shí)質(zhì)、肺動(dòng)脈血管壁上均有不同程度的表達(dá)；p38在APE大鼠的肺實(shí)質(zhì)、肺動(dòng)脈血管壁細(xì)胞核內(nèi)均有表達(dá)。

表1 各組大鼠各時(shí)間點(diǎn)磷酸化P38蛋白OD比值比較

a：P<0.05，與APE組比較

2.2各組大鼠各時(shí)間點(diǎn)肺組織磷酸化p38OD比值比較 APE組各時(shí)間點(diǎn)大鼠肺組織磷酸化p38OD比值高于對(duì)照組和溶劑組(P<0.05)，見表1、圖1。

圖1 各組大鼠處理后8 h磷酸化p38的表達(dá)水平

2.3各組大鼠各時(shí)間點(diǎn)肺組織FKN mRNAOD比值比較 APE組各時(shí)間點(diǎn)大鼠肺組織FKN mRNAOD比值明顯高于對(duì)照組和溶劑組(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠各時(shí)間點(diǎn)FKN mRNA的OD比值比較

a：P<0.05，與APE組比較

圖2 各組大鼠處理后8 h肺組織FKN mRNA的表達(dá)水平

3 討 論

3.1FKN在APE后的表達(dá)及其作用 FKN是1997 年由BAZAN等[5]在用趨化因子的基因探針檢索表達(dá)序列標(biāo)簽數(shù)據(jù)庫(kù)時(shí)發(fā)現(xiàn)的，是目前CX3C-類趨化因子中惟一成員，它是含有多個(gè)結(jié)構(gòu)域的大分子蛋白,人的FKN基因定位在染色體16q13[6]。膜結(jié)合型Fractalkine 存在于活化的細(xì)胞表面，主要起著黏附作用；分泌型Fractalkine主要是對(duì)單核、NK細(xì)胞等具有強(qiáng)有力的趨化作用[7-8]。近年來有報(bào)道指出，炎癥反應(yīng)時(shí)，F(xiàn)KN在單核細(xì)胞和T細(xì)胞募集到血管壁的過程中起重要作用，而且FKN還具有類似于生長(zhǎng)因子促肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖的作用[3]。在APE后，對(duì)FKN的研究較少報(bào)道。

本研究結(jié)果顯示，APE后FKN、p38在肺血管內(nèi)皮、肺泡上皮、支氣管內(nèi)皮上有明顯表達(dá)(P<0.05)。本研究結(jié)果顯示，APE組各時(shí)間點(diǎn)大鼠肺組織FKN mRNA的表達(dá)量明顯高于對(duì)照組和溶劑組(P<0.05)。目前研究認(rèn)為，APE后PAH的形成可能與栓塞后血管周圍大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及其釋放的細(xì)胞因子進(jìn)一步損傷肺動(dòng)脈內(nèi)皮有關(guān)[9]，而表達(dá)增多的FKN對(duì)炎癥細(xì)胞的聚集起到促進(jìn)作用。

3.2p38MAPK通路在APE后被激活從而上調(diào)FKN的表達(dá) 1993年科學(xué)家研究發(fā)現(xiàn)p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，該通路一旦被激活，細(xì)胞質(zhì)中的非磷酸化p38MAPK轉(zhuǎn)化為磷酸化p38MAPK，再移位到細(xì)胞核內(nèi)[10]。本研究中采用Western blot檢測(cè)肺組織磷酸化p38的表達(dá)，結(jié)果顯示隨時(shí)間延長(zhǎng)磷酸化p38的表達(dá)有明顯增高趨勢(shì)(P<0.05)，提示在大鼠APE后，p38MAPK通路被激活。因此本課題組推測(cè)，APE后p38MAPK通路被激活，上調(diào)了FKN的表達(dá)，使得FKN在APE后明顯升高。

此外，有研究報(bào)道FKN在PAH的發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用，值得注意的是損傷的內(nèi)皮細(xì)胞可過度表達(dá)FKN[11-12]，其是否在APE后PAH的形成中起作用有待進(jìn)一步研究。也有研究顯示FKN 所引起的趨化白細(xì)胞、纖維化、凋亡等均可能是心力衰竭的誘因[13-15]。右心功能不全也是APE后PAH的形成的原因之一。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示在APE后8 h內(nèi)，大鼠肺組織中FKN的表達(dá)即明顯升高，作為炎癥趨化因子，F(xiàn)KN對(duì)APE后肺部炎癥反應(yīng)有明顯促進(jìn)作用，從而加重了APE后炎癥反應(yīng)及PAH的形成。