BALB/c小鼠對馬爾尼菲籃狀菌黑素的免疫應答

孫 弦 劉 睿 吳 庭 劉棟華

馬爾尼菲籃狀菌(Talaromrces Marneffei, TM)原名為馬爾尼菲青霉(Penicillium Marneffei, PM)是一種可致人類感染罹患馬爾尼菲籃狀菌病(Talaromycosis Penicilliosis Marneffei, TSM)的深部真菌，具有溫度雙相性。25℃呈菌絲相，產紅色素；37℃呈酵母相，產黑色素[1,2]。TSM患者已分布我國多地，為艾滋病、惡性腫瘤、免疫功能低下患者中較為常見的機會性感染[3,4]，病情極為兇險復雜，死亡率高。前期研究表明，黑素是多種致病真菌的毒力因子，能降低對抗真菌藥物的敏感性，且TM酵母細胞在體外可利用左旋多巴合成多巴型黑素[5]。本研究將以TM黑素顆粒作為抗原，經腹腔多次免疫BALB/c小鼠，采用雜交瘤技術來制備單抗，旨在探討TM黑素能否刺激機體產生免疫應答。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 6～8周齡SPF級雌性BALB/c小鼠，重約20 g。

1.1.2 細胞株 SP2/0-Ag14，中科院上海生命科學研究院。

1.1.3 主要試劑 RPMI-1640培養基(維森特生物技術有限公司)，HT/HAT培養基、FCA/FIA佐劑、人工合成黑素(美國Sigma公司)，牛血清白蛋白、PEG4000(Biosharp公司)，兔抗鼠IgG(SouthernBiotech公司)，羊抗人IgG (北京博奧森生物技術有限公司)

1.1.4 儀器 倒置顯微鏡(美國OLYMPUS公司)，酶標儀、CO2培養箱(美國賽默飛世爾科技)

1.2 方法

1.2.1 抗原的提取 收集黑素化后的TM酵母細胞，通過溶壁酶、變性劑、蛋白酶、濃酸、強堿等步驟處理，獲取純化的TM多巴黑素顆粒，冷藏備用。

1.2.2 動物免疫 小鼠隨機分組，將TM黑素(100 μg、200 μg、300 μg、500 μg)與弗氏完全佐劑/弗氏不完全佐劑充分乳化，經小鼠腹腔注射，0.5～1 mL/只。設生理鹽水和人工合成黑素(100 μg)為空白和陽性對照組。共接種4次，間隔3周，歷時約3個月。收集小鼠腹水及血清-20℃貯存。

1.2.3 細胞融合反應 取免疫小鼠脾細胞懸液和SP2/0細胞(按5∶1或10∶1)在50%聚乙二醇溶液介導下融合，置96孔板(100 μL/孔)，37℃ CO2培養箱中孵育。3天后倒置顯微鏡下逐日觀察，待細胞集落長至1/3～1/4每孔時，收集上清液檢測。

1.2.4 抗體特異性檢測

1.2.4.1 直接凝集反應 稀釋TM黑素至20 μg/mL，于孔板內與免疫小鼠腹水、血清、雜交瘤細胞培養上清液行抗原-抗體反應，搖床水平、勻速、輕搖約5～8 min，記錄有無凝集現象。

1.2.4.2 間接ELISA法 將TM黑素包被于96孔酶標板中，0.1 mL/孔，檢測免疫小鼠腹水、血清、雜交瘤細胞培養上清液中抗體的含量，加入酶結合物兔抗鼠IgG(1：4000)，用酶標比色計測定OD值(TMB 450 nm)。

2 結果

2.1 小鼠免疫后的情況 免疫小鼠出現不同程度的行為、形體及臟器改變，包括反應遲緩、脫毛、腹水，以及脾臟腫大(圖1)等。

2.2 細胞融合反應 融合第3天起成批SP2/0細胞逐漸縮小，核固縮、碎裂，進而凋亡；巨噬細胞(小鼠腹腔細胞)開始增生、肥大，吞噬周圍細胞碎片及雜物。1周左右，單個SP2/0細胞或小鼠脾細胞大量死亡，鏡下可見一種圓形、核較大、成團生長的細胞(圖2)，即為雜交瘤細胞，并不斷分裂、增殖。

2.3 抗體檢測

2.3.1 直接凝集試驗 免疫小鼠血清與TM黑素顆粒自然聚集(圖3)，正常小鼠則均勻分散，并未見凝集現象(圖4)。免疫小鼠的腹水和雜交瘤細胞上清也得出相同結論。另外，選取兩例臨床TSM患者血清與TM黑素顆粒反應，亦出現凝集現象。

2.3.2 間接ELISA法 添加顯色劑TMB后，肉眼可見免疫小鼠腹水、血清以及細胞培養上清液所在孔的顏色較正常小鼠和空白組而言，明顯加深。酶標儀內測得450 nm處的OD值依次為1.635±0.085、1.820±0.249、0.671±0.142。

圖1 免疫小鼠脾臟腫大 圖2 融合反應第7天鏡下觀(×200) 圖3 直接凝集反應(×100) 圖4 直接凝集反應(×100，正常小鼠)

3 討論

TM主要侵犯人體的單核巨噬系統，可致發熱、消瘦、貧血、肝脾腫大、肺部感染、淋巴結腫大、關節疼痛、皮疹等臨床表現，常缺乏特異性，極易誤診、漏診[6]。目前確診TSM的重要手段為真菌培養或病理檢查，但真菌培養周期長且陽性率低，而病理診斷易與其它細胞內病原真菌相混淆。當今，單抗技術早已廣泛運用于真菌學領域，但尚無一種快速、高效、特異性強的方法來檢測TM抗原。Chaiyaroj等[7]制備了兩株TM單抗經ELISA法來檢測TM感染，其敏感性、特異性和準確性分別是92.45%，97.5%，96.59%。Panichakul等[8]用單抗8C3克隆株經ELISA夾心法檢測臨床TM感染患者血液及尿液中的抗原，發現有較高敏感性和特異性。

本實驗在3個月內用TM黑素對BALB/c小鼠多次免疫接種，觀察發現，免疫小鼠有不同程度的形體和行為變化，如脫毛、腹部膨隆、行走緩慢、嗜睡等，解剖后見腹腔內彌漫性腹水，實質性和空腔臟器腫大，包膜增厚及系膜纖維結締組織增生、黏連，以脾臟為重。初步說明TM黑素具有較強的免疫原性，能刺激小鼠產生強烈的免疫應答。當TM黑素量為100 μg時，小鼠就已存在以上反應，當增至500 μg時也未加重或死亡，證明TM黑素在這個區間尚不具備致死性。另外，有學者采用小鼠脾臟內注射免疫，可縮短免疫接種周期，節省了時間、人力、物力，但注射難度大。

經融合反應，在選擇性培養基里有一類細胞存活下來，通過凝集試驗、ELISA法對其培養上清液進行檢測，部分孔出現凝集現象或OD升高的情況，由此證明雜交瘤細胞形成可能。收集陽性孔的瘤細胞擴大化培養，注射到正常小鼠腹腔，抽取腹水后檢測，亦得出相似結論。這與Nosanchuk等[9]利用新型隱球菌黑素制備單抗時基本一致。

研究表明，黑素有保護菌體免受宿主巨噬細胞吞噬及氧化殺傷的作用，感染后可引起宿主強烈的免疫應答。Rosas等[10]給感染新型隱球菌的小鼠注射抗黑素單抗，發現能減輕被感染小鼠菌負荷量，且延長了被感染小鼠的生存時間。接下來，實驗組會利用TM黑素抗體來檢測臨床TSM患者治療前后的血清中抗體滴度的變化，了解其是否可以作為評判TSM預后的標準之一，另將通過動物實驗來探索TM黑素抗體能否增強小鼠對TM感染的抵抗力。本次實驗雖然獲取了雜交瘤細胞，證明了TM黑素的免疫原性，但檢測時發現其陽性反應靈敏度不甚理想，有待更進一步的摸索與驗證。我們將TM黑素與臨床隱球菌感染患者血清進行凝集試驗，并未出現明顯凝集現象，提示TM黑素可能具有一定特異性。毋庸置疑的是，TM黑素抗體的應用研究對臨床工作具有極為重要的理論價值和實用價值，對TSM診斷和治療有指導意義。