絲素蛋白的磷酸化及其仿生礦化膜的制備

周 倩， 袁久剛， 李 瀾， 王 平， 王 強

(生態紡織教育部重點實驗室(江南大學)， 江蘇 無錫 214122)

絲素蛋白不僅可用作纖維原料，因其良好的生物相容性，在生物材料制備中也有潛在用途[1]。為拓寬絲素在生物材料及醫學領域中的應用，不少研究者采用化學或生物的方法進行絲素改性加工，如采用辣根過氧化物酶(HRP酶)催化絲素接枝丙烯酸，加速礦化中絲素表面鈣鹽沉積，制備仿生礦化材料[2]；采用磷酸進行絲素磷酸化，賦予絲素膜抗凝血性，用于制作止血材料等[3]。

羥基磷灰石在自然界中主要由鈣磷灰石(Ca5(PO4)3(OH))自然礦物化形成，羥基磷灰石具有優良的生物相容性和生物活性，可作為骨骼或牙齒的誘導因子被用于骨修復手術中。在生物材料表面生成羥基磷灰石的方法有很多種，按照礦化液的不同大致可分為3類：模擬體液法、交替礦化法和過飽和鈣化溶液法[4]。

本文采用三聚磷酸鈉作為磷酸化試劑對絲素蛋白進行磷酸化，其機制是：絲素蛋白中絲氨酸(Ser)、酪氨酸(Tyr)的羥基和賴氨酸(Lys)的氨基與無機磷發生酯化反應，形成C—O—P和C—N—P的結構[5]。在磷酸化的絲素膜材料基礎上進行仿生礦化，誘導羥基磷灰石的形成，實現絲素基仿生礦化材料的制備。

1 實驗部分

1.1 實驗材料

桑蠶絲練白綢(35.5 g/m2，江蘇鑫緣繭絲綢有限公司)；三聚磷酸鈉(STP)、一水溴化鋰、無水氯化鈣、無水乙醇、十二水磷酸氫二鈉、對二苯酚、鉬酸銨、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、鹽酸等試劑(分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1絲素溶液的制備

將桑蠶絲練白綢溶解在溴化鋰/無水乙醇/水(物質的量比為1∶1∶2)體系中，在75 ℃條件下攪拌2 h得到絲素(SF)溶液，用去離子水對絲素溶液進行透析，直至透析液電導率值小于4 μS/cm，再將絲素溶液離心去除不溶物，以稱量法標定上清液濃度，將絲素溶液在4 ℃條件下保存。

1.2.2絲素的磷酸化

分別取40 g/L的絲素蛋白溶液各30 mL, 用1 mol/L NaOH溶液調節溶液pH值分別為8、9、10。在35 ℃作用下，緩慢加入0.24 g三聚磷酸鈉反應30 min，反應過程中用NaOH溶液調節pH值使其保持在加入STP前的固定值。反應結束后冷卻，調節溶液pH值至中性。為探究STP的用量對絲素磷酸化的影響，同樣條件下控制pH值為10，溫度為35 ℃，分別加入質量分別為0.06、0.24 g的STP(不同質量的STP與SF反應后的溶液分別標記為SF-1, SF-2)，反應30 min。

1.2.3絲素膜的制備

風干膜制備：將STP磷酸化后的絲素溶液中加入0.125 g甘油，混合均勻后將其轉移至聚四氟乙烯模具中，在恒溫恒濕箱中以流延法制備風干膜。

凍干膜制備:將STP質量分別為0.06、0.24 g的磷酸化后的絲素溶液進行透析。透析完畢后將溶液在-50 ℃冷凍干燥成膜，將凍干膜在50%乙醇醇化處理4 h后再次凍干(不同質量的STP與SF反應后的膜分別標記為SF-1膜，SF-2膜)。

1.2.4絲素/羥基磷灰石復合材料的制備

絲素/羥基磷灰石復合材料采用交替礦化法制備[6]。分別取未處理絲素凍干膜和磷酸化絲素凍干膜，用CaCl2/Tris-HCl溶液(CaCl2濃度為500 mmol/L；Tris-HCl濃度為50 mmol/L，pH值為7.45)進行鈣化，先在37 ℃下處理30 min，以去離子水水洗后，再將樣品浸漬在Na2HPO4/Tris-HCl (Na2HPO4濃度為300 mmol/L；Tris-HCl濃度為50 mmol/L，pH值為8.50)溶液中，在37 ℃下處理30 min，然后用去離子水水洗。上述過程被定為1個Ca-P礦化周期，重復7個周期直至結束。作為對比，磷酸化絲素膜只用CaCl2處理，不加Na2HPO4。不同礦化的處理條件如表1所示。

表1 不同礦化處理條件Tab.1 Different mineralization conditions of silk membranes

1.3 分析測試方法

1.3.1磷含量的測定

依據GB 12393—1990《食物中磷的測定方法》，采用磷鉬藍比色法[7]測定磷含量，原理為：無機磷元素在酸性溶液中會與鉬酸銨結合生成磷鉬酸銨，經對苯二酚、亞硫酸鈉還原磷鉬酸銨后會形成藍色化合物鉬藍,其最大吸收波長是660 nm。

磷標準曲線的繪制：分別吸取1～5標準液(磷標準液用磷酸氫二鉀配制，質量濃度為1 mg/mL)至50 mL刻度試管中，然后依次加入2 mL質量分數為5%的鉬酸銨溶液、1 mL質量分數為20%的亞硫酸鈉溶液、1 mL質量分數為0.5%的對苯二酚溶液，加水定容到20 mL，搖晃試管使溶液混合均勻，再靜置30 min。測定溶液660 nm處的吸光度，以標準液質量濃度C(mg/mL)為橫坐標，吸光度A為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程y=0.053 6x+0.089 5，R2=0.996 23。

取反應后溶液5 mL，加入15 mL三氯乙酸溶液(2 mol/L)沉淀絲素蛋白，靜置一段時間后離心，取上層清液2 mL及同樣的空白溶液，分別置于20 mL具塞試管中，其余操作同標準曲線，磷轉移量以磷酸化后體系中磷質量濃度的降低率表示。

1.3.2圓二色譜和粒徑測試

通過圓二色光譜儀檢測絲素溶液二級結構的變化，取絲素樣品加入到1 mm 比色皿中，檢測波長范圍為195～250 nm，掃描速度為100 nm/min。使用粒徑及Zeta 電位分析儀測定25 ℃條件下絲素溶液的粒徑大小和粒徑分布。

1.3.3化學結構分析

采用Nicolet iS 10傅里葉紅外光譜儀(FT-IR)的全反射(ATR)模式，在掃描范圍為4 000～650 cm-1內對不同的冷凍干燥膜樣品進行紅外光譜分析。掃描次數為32，分辨率為4 cm-1。

1.3.4絲素膜對陽離子的吸附效果

以陽離子染料進行絲素膜沾色實驗，沾色工藝條件：溫度為85 ℃，處理時間為30 min，浴比為1∶100，其中染料質量濃度為0.2 g/L。吸附能力以沾色率表示，即膜材料沾色前后染液吸光度的變化率。

1.3.5斷裂強度測試

采用YG141型織物厚度儀測定絲素風干膜厚度，采用萬能材料試驗機測定膜的力學性能，拉伸速度為40 mm/min，夾距為40 mm。測試前將樣品裁剪成尺寸為80 mm×5 mm的樣條，并在恒溫恒濕箱(溫度為20 ℃，相對濕度為65%)中平衡24 h，每個樣品進行10次重復實驗，樣品斷裂強度和斷裂伸長率分別由以下公式計算：

式中：Q為斷裂強度，MPa；P為強力，N；d為厚度，mm；b為膜寬度，mm；ε為斷裂伸長率，%；L′為伸長，mm；L為原長，mm。

1.3.6熱力學性能測試

使用Q200型差示掃描量熱儀測定不同條件處理后的絲素凍干膜。測試條件：樣品質量為5 mg，升溫速度為10 ℃/min，升溫范圍為100～400 ℃，氮氣流量為50.0 mL/min。

1.3.7表面元素測試

將樣品置于能量色散X射線能譜儀中分別進行線掃描和面掃描，測試出絲素膜表面元素含量和分布[8]。

1.3.8形貌觀察

使用SU1510型掃描電子顯微鏡觀察所制備的絲素材料的表觀形態結構，樣品經過噴金處理，掃描加速電壓為5 kV。

2 結果與討論

2.1 pH值和STP質量對磷酸化程度影響

磷轉移量一定程度上反映絲素蛋白的磷酸化效果，采用磷鉬藍比色法測得：當pH值分別為8、9、10時，磷轉移量分別為35.5%、42.3%、67.1%。在pH值為8時磷轉移率最低，在pH值為10時磷轉移率最高。pH值較低時，磷酸根主要與賴氨酸反應，但絲素中賴氨酸含量很低，因此磷酸化程度就低。當堿性增強時，Ser—OH電離成Ser—O-，此時親核取代效應增強，游離的磷酸根基團與Ser—O-基團反應，氨基酸殘基側鏈中的羥基活性會變得越來越高[9]，絲素蛋白磷酸化程度增加。

圖1示出不同質量的STP對磷酸化程度的影響。當STP質量較低時，隨著STP質量的增加，磷酸化程度顯著增加；當STP質量達0.12 g時，磷酸化程度趨于穩定。這表明磷酸根較少時，不是所有氨基酸殘基都能夠參加反應，有些可能因空間位阻和所處的化學環境限制了其反應[10]。當磷酸根足夠多時，氨基酸殘基能充分反應，磷酸化程度最大并趨于穩定。

圖1 不同質量的STP對磷酸化程度的影響Fig.1 Effect of mass of STP on phosphorylation

2.2 磷酸化對絲素蛋白結構和粒徑的影響

采用圓二色譜考察了絲素經過磷酸化后二級結構的變化，結果見圖2。可看出，絲素溶液在220 nm處有負峰，這說明絲素蛋白的二級結構以α螺旋為主[11]。當用STP處理后，220 nm 處負峰強度增大，表明絲素蛋白的二級結構發生了變化。通過計算得到絲素蛋白二級結構的分布，見表2。

由表2可知，SF的螺旋結構最少，無序度最高。當用STP處理SF后，其樣品的螺旋結構都增加了，無規卷曲都有不同程度的減少，即磷酸化使得絲素的結構更加完整，這也為后續的絲素膜材料構建奠定了良好的結構基礎。

圖2 STP處理后絲素溶液的圓二色譜圖Fig.2 Circular dichroism of silk fibroin solution after STP treatment

%

由表2還可看出，當STP質量為0.06 g時，其螺旋結構最多，無規卷曲最少，即適度的磷酸化對絲素蛋白結構影響較大。

為進一步驗證磷酸化對絲素溶液粒徑產生的影響，測定了反應前后絲素溶液的粒徑分布變化，結果如圖3所示。可以看出，3組樣品的主要粒徑分布范圍在100～250 nm之間，其中SF的平均粒徑和多分散性指數(PDI)分別為143.5 nm和0.528。當用STP處理SF 溶液后，粒徑分布都有不同程度的增大。STP質量為0.06 g時，平均粒徑和PDI分別為158.5 nm和0.566；而當STP質量為0.24 g時，絲素溶液的平均粒徑增大到171.5 nm，PDI為0.615。這是因為磷酸根的引入使得絲素溶液間的靜電斥力增加，使得粒徑分布增加。

圖3 STP處理后絲素溶液的粒徑分布Fig.3 Size distribution of fibroin solution after STP treatment

2.3 磷酸化絲素化學結構分析

為進一步證明絲素中氨基酸與STP發生反應的結構變化，利用紅外光譜儀的全反射模式對不同處理條件的絲素膜進行測試，其結果如圖4所示。可以看出，絲素蛋白的特征酰胺鍵主要分布在1 654、1 513 cm-1附近，表明經過冷凍干燥后的再生絲素蛋白材料以無定形結構為主[12]。STP中磷酸根的特征峰在896 cm-1處，絲素經過STP處理后，在921 cm-1處有新峰，其位置對應是P—O鍵的伸縮振動峰[13]，即證明絲素成功被STP磷酸化。

圖4 磷酸化的絲素凍干膜ATR-FT-IR光譜圖Fig.4 ATR-FT-IR spectra of phosphorylated silk fibroin

2.4 磷酸化絲素膜對陽離子的吸附效果

磷酸化影響絲素蛋白表面電荷分布，使得絲素蛋白分子表面負電性基團增多。借助陽離子染料沾色實驗，探究磷酸化絲素表面對陽離子的吸附。結果發現，STP質量為0、0.06、0.24 g時對應的沾色率分別為9.3%、16.2%、31.8%。磷酸化會在蛋白質分子中引入負電性磷酸根基團，陽離子染料帶正電，與絲素間結合力主要為庫侖引力。根據絲素膜表面沾色率變化，可判別出絲素膜磷酸化的程度。當STP質量為0.24 g時,絲素對染料的沾色率增至31.8%，表明絲素磷酸化有利于膜表面陽離子的吸附，為后續絲素表面鈣磷酸鹽的吸附和沉積奠定了基礎。

2.5 磷酸化對絲素熱力學和力學性能影響

為深入分析磷酸化對絲素膜材料熱力學性能的影響，采用差示掃描量熱儀分析絲素膜的熱力學轉變溫度，結果如圖5所示。可以看出，SF蛋白膜存在3個明顯的吸熱峰，其中在50、121 ℃附近的吸熱峰分別是由于自由水和結合水的蒸發引起的，在278 ℃附近的吸熱峰則是由于絲素蛋白膜材料熱降解引起的，該溫度為絲素蛋白的熱分解溫度[14]。經過STP處理后的SF膜，絲素蛋白的熱性能發生了較小的變化，但從圖5可看出，當溫度升高到285 ℃左右以后，經過磷酸化的SF膜完全被降解，可見STP的引入使得SF膜的熱穩定性有所下降。原因是：磷酸根的引入使得絲素蛋白質分子間的氫鍵被大量破壞，引入大量負電基團使靜電斥力加大，從而導致樣品的熱性能急劇降低。

圖5 磷酸化絲素膜的DSC曲線Fig.5 DSC curves of phosphorylated silk fibroin membranes

為探究絲素磷酸化對風干膜材料力學性能的影響，測定了絲素風干膜的斷裂強度和斷裂伸長率，結果如圖6所示。可以看出：當STP質量為0.06 g時，對應的樣品斷裂強度和斷裂伸長率最高；當STP質量為0.24 g，所對應的樣品斷裂強度、斷裂伸長率最低。當STP質量為0.24 g時，樣品斷裂強度下降，這是因為在磷酸化過程中，蛋白分子中羥基或氨基磷酸化后，不僅使分子間氫鍵減少，且引入的負電磷酸根基團加大了蛋白分子間的靜電斥力。當STP質量為0.06 g時，樣品斷裂強度比原樣稍有提高。從絲素二級結構可看出，絲素蛋白經0.06 g STP處理后，無序度最低，且螺旋結構變多，使得力學性能增加，即抵消了磷酸化對膜材料強力的消極影響。

圖6 磷酸化絲素膜的力學性能Fig.6 Mechanical properties of phosphorylated silk fibroin membranes

2.6 仿生礦化膜表面元素和形貌分析

采用能量色散X射線能譜儀分析經過仿生礦化絲素膜表面不同元素的含量，其結果如表3所示。當SF經STP處理后，引入了部分磷酸根，因此將磷酸化后的絲素膜只用CaCl2處理時，其中Ca元素和P元素含量隨著磷酸化程度的提高而增加，其中P元素的引入都是STP磷酸化導致的，也因此間接反映磷酸化程度。當用CaCl2/Na2HPO4對磷酸化的絲素膜進行仿生礦化后，Ca元素和P元素含量都相比只用CaCl2礦化的絲素膜高。

表3 仿生礦化后的絲素膜表面元素含量Tab.3 Element contents of silk fibroin membrane surfaces after bionic mineralizction %

為更直觀地觀測絲素膜礦化后的變化，借助掃描電鏡對各個絲素膜的形貌變化進行觀察，結果如圖7所示。

圖7 不同礦化條件下絲素膜的形態結構(×300)Fig.7 Morphological structures of silk membranes under different mineralization conditions(×300)

從圖7可看出，未經磷酸化處理的SF膜表面很光滑，經過CaCl2/Na2HPO4交替礦化處理的SF膜表面變得很粗糙，有少量顆粒狀無機物生成，表明有磷酸鈣鹽或羥基磷灰石晶體生成，但其分布并不均勻。隨著磷酸化程度增加，SF/STP處理膜表面生成的羥基磷灰石晶體逐漸增多，且分布較均勻。礦化過程中用CaCl2/Na2HPO4處理的絲素膜表面生成的羥基磷灰石數目比僅用CaCl2處理的絲素膜要多，即絲素經STP磷酸化后，提供了部分的磷酸根，從而為礦化過程提供了更多的沉積位點。

3 結 論

1)絲素蛋白在三聚磷酸鈉質量為0.24 g、pH值為10、35 ℃條件下處理30 min，獲得了較好的磷酸化效果；絲素經過磷酸化處理后，蛋白二級結構和分子粒徑發生變化，磷酸化絲素膜對陽離子的吸附能力較空白樣增加。

2)采用三聚磷酸鈉作為磷酸化試劑對絲素蛋白的力學與熱穩定性有影響，當磷酸化程度較高時，絲素膜材料的力學與熱力學性能發生不同程度的下降。

3)磷酸化絲素膜經CaCl2/Na2HPO4交替礦化處理后，其表面較空白樣生成更多羥基磷灰石，采用三聚磷酸鈉作為磷酸化試劑有利于絲素基仿生礦化材料的制備。

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