磺胺和四環素類抗生素對大腸桿菌聯合突變效應的研究

宋雪薇，馬清萍，于洋，宋春磊，林志芬，張飲江,*

1. 上海海洋大學海洋生態與環境學院，上海 201306 2. 環境保護部固體廢物與化學品管理技術中心，北京 100029 3. 污染控制與資源化研究國家重點實驗室，同濟大學環境科學與工程學院，上海污染控制與生態安全研究院，上海 200092

我國作為世界上抗生素的最大消費國，每年抗生素的消費量達20萬噸[1]。殘留的抗生素在許多水域都有檢出，如黃浦江上游支流中檢測到四環素類抗生素含量為34.25～211.82 ng·L-1 [2]；南方某水庫中檢測到磺胺類抗生素殘留量最大為130 ng·L-1 [3]。磺胺和四環素類抗生素因具有價格低、抗菌譜廣等優點被廣泛使用，使得耐藥菌大量產生，從而嚴重危害到人類健康[4]。因此，深入研究這2類抗生素對抗性基因形成的影響，對預防細菌耐藥性產生具有一定的參考價值。

環境中殘留的抗生素多為混合暴露，對微生物有聯合毒性效應。如任皓等[5]發現鹽酸金霉素、鹽霉素和黃霉素兩兩分別組合對發光細菌的聯合毒性表現為拮抗作用；高禮等[6]指出四環素和金霉素聯合作用于羊角月牙藻時，聯合毒性表現為相加作用，這會導致環境危害進一步加深[7]。目前，對抗生素的聯合暴露研究主要以生長毒性效應作為指標[8]，多用毒性單位(TU)來表征混合物的聯合毒性效應，較少考慮其在環境中對微生物造成的致突變效應。

細菌獲得抗性基因途徑有2種，一種是個體間的水平轉移，如宋春磊等[9]探討了在單一及聯合作用下抗生素對接合轉移頻率的影響；另一種是在非致死的選擇條件下，細胞會高頻率地產生適應外界環境的有利突變[10]，導致抗性基因的產生，如采用四環素誘導，可使細菌對氟喹諾酮類抗生素產生耐藥性[11]，喹諾酮等抗生素會使細菌產生耐藥基因的濃度發生變化[12]。目前對抗生素致突變的研究主要用于藥物治療，邵世峰等[13]認為聯合使用抗生素更容易避免耐藥基因的富集。但目前關于聯合突變的研究較少，多為單一抗生素的突變效應，需要進一步研究混合抗生素的突變效應。

本文選擇磺胺類抗生素(磺胺氯噠嗪(SCP)、磺胺二甲嘧啶(SMZ))和四環素類抗生素(二甲胺四環素(MH)、鹽酸四環素(TH)和鹽酸強力霉素(DH))作為研究對象，研究其對大腸桿菌突變的單一和聯合突變效應，初步探索了抗生素聯合暴露對大腸桿菌的致突變風險，為有效解決抗生素的耐藥性與生態風險評價等問題提供理論依據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試劑

所用試劑均購于Sigma-Aldrich化學制品有限公司(St. Louis, MO, USA)，純度均≥99%，無需再提純。大腸桿菌(E.coliMG-1655)菌株購買于北京譜如汀生物技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 突變效應的測定

工作菌液的制備：用接種環將F3菌種接入含5 mL單倍液體LB培養基的小搖瓶中，在37 ℃恒溫震蕩培養6 h至對數生長期，通過稀釋或離心濃縮將OD600(菌液在600 nm處的吸光值)調整為0.5±0.01，然后使用1% NaCl稀釋105倍，磁力攪拌后使細菌為工作菌液，可直接用于暴露實驗。

單一暴露：采用微量肉湯稀釋法對受試抗生素進行暴露實驗，將待測化合物稀釋成等對數梯度系列濃度，加入96孔板，每個濃度梯度點至少設置32個平行，同時設置對照組，培養12 h至穩定期。

混合暴露：將2種藥物按照等MIC(minimum inhibitory concentration, 最低抑菌濃度)比例進行混合，隨后逐級稀釋并暴露，方法與單一暴露相同。

生長效應測定：取30 μL稀釋后的菌液至不含抗生素的平板培養基中，37 ℃ 恒溫靜置培養12 h，對篩選板上的菌落進行計數。

突變測定：從不加抗生素的對照組與各樣本點取菌液至40 mg·L-1利福平篩選平板上，37 ℃恒溫培養箱中靜置培養12 h后對篩選板上的菌落計數。

1.2.2 數據處理

抗生素在濃度為c時對受試菌的毒性大小用抑制率pc來表述，計算方法如公式(1)所示。

(1)

式中pc表示c濃度下抗生素對受試生物的抑制率；Ac表示生長效應測定中c濃度處理組的菌落數目平均值；A0表示生長效應測定中空白對照組的菌落數目平均值。

采用Weibull方程(2)作為擬合模型對毒性數據進行擬合[14]，從而獲得更精確的MIC。

(2)

式中pmax表征劑量效應曲線最高劑量的抑制率pc；p0表示濃度c為0時的抑制率pc。根據擬合出的方程求出pc為pmax時所對應的最小濃度c，即為抗生素的MIC。

化合物對大腸桿菌的突變效應由促進率表示，計算如公式(3)所示：

(3)

式中，P表示促進率，f0、fc分別表示對照組、c濃度下在利福平培養基中篩選出的菌落數目平均值。

化合物對大腸桿菌的突變率促進率用Pm表示，計算公式如(4)所示：

(4)

表1 所用化合物及其相關參數Table 1 Detailed information of test chemicals

注： MIC為最低抑菌濃度，指抑制細菌生長80%的最低藥物濃度。

Note： MIC stands for minimum inhibitory concentration, the lowest drug concentration that inhibits bacterial growth of 80%.

式中fc表示c濃度下利福平培養基中篩選出菌落數目平均值；Ac表示生長效應測定中c濃度處理組的菌落數目平均值；f0表示對照組在利福平培養基中篩選出的菌落數目平均值；A0表示生長效應測定中對照組的菌落數目平均值。

2 結果與討論(Results and discussion)

2.1 磺胺和四環素單一暴露對大腸桿菌的突變效應

圖1 磺胺和四環素類抗生素單一暴露對大腸桿菌的突變效應注：黑色方形為突變率促進率，紅色圓形為突變次數促進率，紅色實線為突變次數促進率擬合曲線，紅色柱形為突變次數，白色柱形為總菌數。Fig. 1 Mutation effects of single exposure of sulfonamide and tetracycline on Escherichia coliNote: the black square is the promoting rate of mutation rate; the red circle is the promoting rate of mutation times; the red solid line is fitting curves of the promoting rate of mutation times; the red column is the mutation times; the white column is the total number of bacteria.

本文選取2種磺胺類抗生素(SCP、SMZ)和3種四環素類抗生素(MH、TH、DH)為受試化合物，測定了其單一暴露對大腸桿菌的突變效應，并用Origin軟件中的Weibull函數進行擬合，R2均大于0.7，結果如圖1所示。

由圖1可知，SCP和SMZ對大腸桿菌突變具有促進效應。SCP在濃度為8.8E-07 mol·L-1時突變次數促進率最大，為94.3%(如圖1a)；SMZ在濃度為1.8E-05 mol·L-1時突變次數促進率最大，為145.06%(如圖1b)。SCP和SMZ在EC0(最大無效應濃度)處能夠明顯促進大腸桿菌的突變，這是由于磺胺能夠作用于葉酸合成通路相關蛋白，抑制葉酸的合成[15]，而葉酸是合成dNTP庫(胞內各游離脫氧核糖核苷三磷酸的含量)的原料，dNTP庫的平衡對維持體內遺傳穩定有重要作用。因此，當葉酸的合成受到抑制后，會影響細胞的突變率[16]。

由圖1c, 1d, 1e四環素類抗生素的劑量效應關系可知：當所研究的四環素類抗生素濃度大于EC0時，雖然能夠誘導產生適應性突變，但是突變次數在整體上還是被抑制。這可能是由于四環素類抗生素阻礙了細菌的蛋白質分泌[17]，從而影響到了突變率[18]。因此，推斷四環素類抗生素進入環境后產生的風險小于磺胺類抗生素。

2.2 磺胺和四環素聯合暴露對大腸桿菌的突變效應

根據單一暴露的結果，采用等MIC聯合暴露方法，測定了磺胺與磺胺(SCP+SMZ)、磺胺與四環素類抗生素(SCP+DH、SCP+TH、SCP+MH)聯合暴露對大腸桿菌的生長及突變促進率的影響，并用Origin軟件中的Weibull函數進行擬合，結果如圖2(a, b, c, d)所示，其中，相對濃度表示實際濃度與化合物MIC(最低抑菌濃度)濃度的比值。

圖2 抗生素對大腸桿菌的聯合突變效應注：藍色實心點為突變次數促進率，紅色空心點為生長促進率；藍色實線為突變次數促進率擬合曲線，紅色虛線為生長促進率擬合曲線；圖a為SCP+SMZ，圖b為SCP+DH，圖c為SCP+TH，圖d為SCP+MH。Fig. 2 Mutation effects of combined exposure of antibiotics on Escherichia coliNote: the blue solid point is promoting rate of mutation times; the red hollow point is mutation rate; the blue line and the red line are curve fitting; figure a is SCP+SMZ, b is SCP+DH, c is SCP+TH, d is SCP+MH.

研究表明，磺胺與磺胺對大腸桿菌的聯合毒性為相加效應，磺胺與四環素類抗生素之間的聯合毒性具有拮抗效應，但是目前還沒有方法對突變聯合效應進行研究[19]。為了研究抗生素對大腸桿菌突變效應的聯合作用，本文參考生長毒性聯合作用的計算方法，從聯合毒性TU推測采用抗性毒性單位(RU)來表征混合物對突變聯合效應，如公式(5)所示：

(5)

式中，Ci,RCx是混合物對受試生物達到RCx效應濃度時各組分i的濃度，RCx,i是組分i在單一暴露時的RCx效應濃度。本文使用RCmax作為RCx進行了RU計算，以確定混合物對這3個濃度效應的聯合效應。當RU<0.8時，聯合效應為協同，當0.8≤RU≤1.2時，聯合效應為相加，當RU>1.2時，聯合效應為拮抗。

同時參照毒性實驗中的毒性表征方法，根據擬合出的抗生素與突變促進率的劑量效應曲線計算了磺胺與磺胺、磺胺與四環素聯合暴露時的抗性單位RU，突變促進率為1%時最低可觀測突變促進效應濃度RC0-1及最高可觀測突變促進效應濃度RC0-2，突變促進率的最大值Pmax及其對應的濃度RCmax及突變促進面積PA。RCmax可以理解為抗生素對突變促進作用開始降低的起始濃度，RC0-2是抗生素對突變促進作用結束的終點濃度和突變抑制作用開始的起點。這2個參數均是突變效應被抑制的重要參數。其中，對突變沒有Hormesis效應的化合物，可以認為是促進效應面積無限趨近于0，此時RC0-1、RCmax、RC0-2均約等于RC0，因此本文使用RC0作為沒有突變Hormesis效應的化合物的RC0-1、RCmax和RC0-2。計算獲得的突變效應數據如表2所示。

由表2可看出：SCP與SMZ聯合作用下RC0-2減小，說明聯合暴露能夠導致突變促進效應的濃度區間向低濃度偏移，在基于RCmax的計算中，SCP+SMZ的RU介于0.8和1.2之間，說明磺胺混合物對促進突變效應的聯合作用是相加。除此以外，聯合暴露的PA大于單一暴露時的PA。因此，推測SCP與SMZ的聯合具有一定的環境風險。

圖2b, 2c, 2d的RC0-2介于2個化合物單一的RC0-2之間，可看出四環素與磺胺的聯合暴露從整體上減弱了SCP單一暴露時對突變的促進作用。SCP+DH、SCP+TH、SCP+MH的RU均大于1.2，說明磺胺與四環素類抗生素混合物對促進突變效應的聯合作用是拮抗。同時，磺胺和四環素類抗生素聯合暴露時的Pmax和PA均小于磺胺單一暴露時的Pmax和PA，說明這2類抗生素聯合暴露的促進突變環境風險不會超過單一暴露的促進突變環境風險。

同時，Yang等[19]指出當受試生物為羊角月牙藻時，SMZ+SMX的TU為1.1，即這2種磺胺的聯合毒性為相加效應；在Long等[20]的研究指出，以大腸桿菌為受試生物，SCP+TH的TU為1.47，即磺胺與鹽酸四環素的聯合毒性為拮抗效應。可以看出本文中TU與RU的效應相同，可能存在一定的相關關系，有待于未來進一步的研究。可考慮用TU推測RU,并用RU法來評價混合物的聯合突變效應。

表2 典型抗生素單一及聯合暴露時突變促進效應濃度及其聯合作用Table 2 Mutation promoting effect concentration and combined action of typical antibiotics in single and combined exposure

綜上，本文主要研究了2類抗生素的二元混合對大腸桿菌的突變效應，發現:(1)低濃度的單一暴露下，四環素類抗生素對大腸桿菌產生的突變風險小于磺胺類抗生素；(2)磺胺類抗生素混合(SCP+SMZ)對突變效應的聯合作用為相加，磺胺與四環素類抗生素混合(SCP+DH、SCP+TH、SCP+MH)對促進突變效應的聯合作用為拮抗；(3)抗性毒性單位(RU)法可以考慮用來評價抗生素混合對突變的聯合效應。

在此基礎上，可進一步開展：(1)三元及以上的混合抗生素聯合毒性與聯合突變效應的研究；(2)聯合毒性(TU)與抗性毒性單位(RU)的相關性研究。隨著對抗生素在環境中混合暴露的研究深入，了解更多抗生素的生物學效應與評價方法，可進一步為評估暴露在環境中的抗生素風險提供幫助。

致謝：本研究受同濟大學污染控制與資源化研究國家重點實驗室自主研究(重點)項目(PCRRK16007)；國家自然科學面上基金(21577105，21777123)；國家水體污染控制與治理重大專項(2018ZX07109-1)；上海市科學技術委員會科研計劃課題(14DZ2261100，17DZ1200103)；環境化學與生態毒理學國家重點實驗室開放基金課題(KF2016-11)資助。