小鼠肝炎病毒診斷技術(shù)的研究進(jìn)展

劉森權(quán)

【摘 要】 小鼠肝炎是由小鼠肝炎病毒導(dǎo)致的一種傳染病，小鼠肝炎病毒自然感染是經(jīng)口和呼吸道途徑。目前國內(nèi)外的診斷技術(shù)主要有很多，例如病理學(xué)診斷、RT-PCR、IFA、MFI等。本文旨在對MHV的診斷技術(shù)做出綜述，分析現(xiàn)有檢測技術(shù)優(yōu)缺點(diǎn)，為今后研究MHV的診斷技術(shù)提供理論依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】 小鼠肝炎病毒；病理學(xué)診斷；RT-PCR；免疫膠體金

MHV感染不但可以改變機(jī)體各種免疫應(yīng)答參數(shù)，也可以改變其酶系統(tǒng)，從而影響小鼠健康，嚴(yán)重則影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。故MHV的早期快速檢測是實(shí)驗(yàn)用小鼠質(zhì)量檢測的重要舉措。本文綜述了現(xiàn)有MHV診斷技術(shù)的研究進(jìn)展。

1 病原

MHV在分類上屬冠狀病毒科，冠狀病毒屬，為單股RNA 。MHV粒子呈球形，具有多形性，直徑為80～220nm，有一層脂質(zhì)的囊膜。膜上結(jié)合著三種結(jié)構(gòu)蛋白，分別為纖突蛋白S、膜蛋白M和小膜蛋白E[1]。現(xiàn)今已分離到的病毒株有MHV-1 、MHV-2 、MHV-3 、MHV-JHM、MHV-A59 、MHV -S 、MHV -Z 、MHV -U 等。其中MHV的嗜神經(jīng)毒株能感染靈長類動(dòng)物，引起急性的腦脊髓膜炎和脫髓鞘。MHV的自然感染途徑為口及呼吸道，也可通過母嬰傳播。群體內(nèi)的傳染源是感染小鼠的糞便和墊料。不帶母源抗體的乳鼠感染后發(fā)病率和死亡率較高。

2 MHV診斷技術(shù)

目前，國內(nèi)外對MHV感染的診斷方法有很多，如酶聯(lián)免疫吸附法、免疫熒光試驗(yàn)、RT-PCR等。實(shí)驗(yàn)室常用ELISA 、IEA等檢測感染后期的特異性抗體，用病毒分離和電鏡觀察等來早期檢測MHV感染情況 。

2.1 病理學(xué)診斷

小鼠群MHV感染時(shí)肝出現(xiàn)大量特征性組織損傷，而部分MHV株幾乎不會(huì)引起病理學(xué)變化，所以還要通過其他方法來確診。MHV小鼠感染任何毒株均會(huì)在肝臟上出現(xiàn)多個(gè)點(diǎn)狀白色壞死灶。MHV呼吸株感染后，其肝臟血管周圍淋巴細(xì)胞浸潤，血管內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)壞死，可見局灶性壞死灶，壞死灶周圍肝細(xì)胞固縮。

2.2 ABC染色法

用ABC染色法可對小鼠肝炎病毒進(jìn)行快速診斷，小鼠感染MHV-3后24～48h后可檢測出來[1]。但ABC染色穩(wěn)定性較差，必須注意親和素與生物素酶的配比，國內(nèi)也并未普及。

2.3 血清學(xué)方法

血清學(xué)方法是MHV檢測技術(shù)中最常用的一種方法，可用于檢測感染后期的特異性抗體。包括酶聯(lián)免疫吸附法、間接免疫熒光試驗(yàn)、免疫酶試驗(yàn)、多重?zé)晒饷庖邷y定等。

2.3.1 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA） ELISA檢測MHV時(shí)具有高度的敏感性、易操作和耗時(shí)短等優(yōu)點(diǎn)。但由于MHV不同毒株間抗原性存在差異，在實(shí)際檢測過程中，多采用多價(jià)抗原。許寶華等[2]利用兩種不同組織嗜性的小鼠肝炎病毒組合抗原包被酶標(biāo)板建立間接ELISA檢測MHV抗體，可檢測出更多的陽性樣品。但是ELISA的結(jié)果需通過肉眼觀察其顏色來判定，存在一定的主觀色彩。一般用于感染后期作回溯性診斷。

2.3.2 間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA） IFA相對于ELISA而言特異性更高，通常作為確診的手段。當(dāng)鼠群中用ELISA檢測出的陽性樣本可用IFA來確診。但是IFA的結(jié)果偏主觀，不適合大量篩選的樣本。

2.3.3 免疫酶試驗(yàn)（IEA） IEA法與ELISA法同是免疫酶技術(shù)，二者檢測小鼠血清標(biāo)本中MHV抗體符合率可達(dá)91. 8% 以上。既IEA法理論上也可以應(yīng)用于實(shí)際。但是由于MHV 病毒不易制備IEA抗原細(xì)胞，國內(nèi)未普及。

2.3.4 多重?zé)晒饷庖邷y定（MFI） MFI法相對于其他方法具靈敏特異性更高，可以篩選在同一個(gè)反應(yīng)孔的動(dòng)物血清中的多種病原體的抗體或抗原 。

2.4 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）

反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）是目前最好的確診方法之一，其具有快速、簡單和靈敏等優(yōu)點(diǎn)。雖然目前RT-PCR的應(yīng)用任然存在實(shí)驗(yàn)室要求高，檢測時(shí)間長等局限性，但是RT-PCR具有病毒檢測所需樣本量少、可檢測早期病毒感染的優(yōu)點(diǎn)，也得到了研究者們的重視。

2.5 免疫膠體金技術(shù)

免疫膠體金技術(shù)是一種新型免疫標(biāo)記技術(shù)。該技術(shù)具有很強(qiáng)的穩(wěn)定性，操作方便快捷，且其免疫性高、特異性強(qiáng)。主要方法有膠體免疫層析法（GICA）和快速免疫金滲濾法（DIGFA）。GICA廣泛應(yīng)用于感染性疾病的調(diào)查。胡曉燕等[3]利用抗小鼠肝炎病毒多抗研制雙抗體夾心法GICAs，建立了小鼠肝炎病毒快速檢測方法。該方法10 min就可以檢測出MHV，且重復(fù)效果良好。

2.6 逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢查技術(shù)（RT-LAMP）

Notomi等開發(fā)的RT-LAMP可以在等溫條件下高特異性、高效率和快速的擴(kuò)增DNA。不需要模板的熱變性和長時(shí)間溫度循環(huán)。Hanaki等發(fā)現(xiàn)PT-LAMP的靈敏度比PT-PCR高3.2倍，比巢式PT-PCR低31.6倍。PT-LAMP更適用于監(jiān)測小鼠群中的活性MHV感染。

筆者認(rèn)為，各個(gè)檢測方法各有其優(yōu)缺點(diǎn)， ELISA特異性好、重復(fù)性差敏感度低，雖然可處理大量樣本但其結(jié)果偏主觀，且對潛伏期感染、免疫缺陷及無血清生物者無法檢測。間接ELISA有較好的特異性、重復(fù)性和敏感性，但是高低度病毒難以獲得，病毒分離很復(fù)雜。IEA由于其抗原細(xì)胞難以制備，所以國內(nèi)并未常使用該方法檢測MHV。MFI法相對于其他方法更加靈敏特異性更高，并可以篩選在同一個(gè)反應(yīng)孔的動(dòng)物血清中的多種病原體的抗體或抗原。RT-PCR法有較好的特異性、重復(fù)性和敏感性，可快速簡單的檢測，并對潛伏期感染、免疫缺陷及無血清生物者均能檢測。但RT-PCR法操作復(fù)雜，檢測時(shí)間較長，對技術(shù)、設(shè)備等要求較高。逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測技術(shù)有良好的特異性和敏感性，且經(jīng)濟(jì)高效在短時(shí)間內(nèi)可完成反應(yīng)，但該方法缺乏客觀的標(biāo)準(zhǔn)指標(biāo)。免疫膠體金技術(shù)，有很好的特異性、重復(fù)性和敏感性，且操作簡單，檢測更為迅速，只需要10分鐘即可得到結(jié)果，但其的符合率需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

3 預(yù)防和控制

雖然MHV對環(huán)境和消毒劑的抵抗力較弱，但由于其高度傳染性和變異性，使得MHV任然是實(shí)驗(yàn)鼠群難以消除的病毒之一[1]。預(yù)防和控制關(guān)鍵措施在于建立無病毒鼠群，要通過嚴(yán)格的檢疫措施中斷傳播循環(huán)，從而控制該病。加強(qiáng)未感染鼠群的飼養(yǎng)管理。對引進(jìn)的動(dòng)物必須進(jìn)行血清學(xué)等的檢查。同時(shí)采用剖腹產(chǎn)避免MHV的垂直傳播。

4 問題與展望

現(xiàn)如今實(shí)驗(yàn)動(dòng)物安全性問題得到廣泛重視，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物安全與實(shí)驗(yàn)人員的生命與健康及實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性息息相關(guān)。我們應(yīng)該控制MHV的感染和傳播，特別是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物機(jī)構(gòu)必須保證其售賣實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的質(zhì)量，嚴(yán)格監(jiān)測MHV的感染，控制MHV的傳播。近年來，MHV的檢測技術(shù)在不斷的進(jìn)步和創(chuàng)新，雖然進(jìn)展緩慢，且各方法均存在一定的缺陷。但隨著對MHV研究的不斷深入，我們期望能發(fā)現(xiàn)更多特異性、重復(fù)性和敏感性更高的檢測方法。