8株攜帶blaNDM-1基因陰溝腸桿菌耐藥性研究

文江雄， 劉 洋， 鄔小萍， 張 偉， 程 娜， 向天新

陰溝腸桿菌是臨床常見的醫(yī)院感染病原菌，可引起包括泌尿道、皮膚和軟組織、呼吸道、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等各種感染，并也可在新生兒病房流行[1]。碳青霉烯類抗生素是治療產(chǎn) ESBL細(xì)菌所致感染的重要抗生素。但隨著臨床上碳青霉烯類抗生素廣泛使用，導(dǎo)致對(duì)該類抗生素耐藥的菌株日益增多，耐碳青霉烯類抗生素的陰溝腸桿菌也頻見報(bào)道，其耐藥機(jī)制主要是細(xì)菌產(chǎn)碳青霉烯酶[2]。碳青霉烯酶是指對(duì)亞胺培南、美羅培南和厄他培南等碳青霉稀類抗生素具有水解能力的一類酶。目前已發(fā)現(xiàn)該類酶的種類已多達(dá)數(shù)十種，主要有Ambler分子分類中的A、B、D類酶[3]。NDM酶屬于Ambler分類中的B類酶，是近年發(fā)現(xiàn)的金屬β內(nèi)酰胺酶。該酶發(fā)現(xiàn)于耐多藥的肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌。研究發(fā)現(xiàn)其耐藥性由一種金屬酶引起，并將該酶命名為NDM-1[4]。NDM的表型及基因型向多樣性發(fā)展，也有其他亞型發(fā)現(xiàn)，目前陰溝腸桿菌中只有NDM-1一種亞型被發(fā)現(xiàn)，但是產(chǎn)碳青霉烯酶的陰溝腸桿菌已經(jīng)是造成臨床重癥感染的菌株之一。南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院于2016年1月－2017年6月分離的陰溝腸桿菌中篩出145株對(duì)碳青霉烯類抗生素不敏感的陰溝腸桿菌。對(duì)這些陰溝腸桿菌的耐藥現(xiàn)狀及其對(duì)碳青霉烯類耐藥的主要機(jī)制進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室研究，發(fā)現(xiàn)8株陰溝腸桿菌攜帶blaNDM-1基因，現(xiàn)對(duì)其研究結(jié)果報(bào)道如 下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 收集 2016 年 1 月－ 2017 年 6月我院各臨床標(biāo)本分離的501株陰溝腸桿菌，從中篩出 145 株對(duì)碳青霉烯類抗生素不敏感的陰溝腸桿菌（亞胺培南或美羅培南MIC≥2 mg/L，剔除重復(fù)菌株）作為實(shí)驗(yàn)菌株，所有受試菌株均由法國(guó)生物梅里埃 VITEK 2-Compact 全自動(dòng)微生物分析儀進(jìn)行鑒定和藥敏試驗(yàn)。藥敏試驗(yàn)結(jié)果按2017年CLSI折點(diǎn) 統(tǒng)計(jì)分析耐藥率和敏感率[5]。對(duì)所有患者臨床資料調(diào)查分析發(fā)現(xiàn)，均無國(guó)外旅游史。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌 ATCC 25922和肺炎克雷伯菌ATCC 700603。

1.1.2 儀器和試劑 DNA Marker購自大連TaKaRa公司；2xTaq PCR Master Mix酶， Ex Taq DNA聚合酶均購自Vazyme公司；美羅培南（10 μg/紙片，英國(guó) OXOID 公司），亞胺培南（美國(guó)Amresco公司），胰蛋白胨大豆肉湯（ trypticase soy broth，TSB） 培養(yǎng)基購自溫州康泰生物公司；瓊脂糖購自上海生工生物技術(shù)有限公司；VITEK 2-Compact全自動(dòng)微生物鑒定儀購自法國(guó)生物梅里埃公司；PCR儀購自德國(guó)Eppendorf公司；電泳儀購自美國(guó)Bio-Rad公司；凝膠成像儀購自北京六一公司，相關(guān)擴(kuò)增引物參照有關(guān)文獻(xiàn)，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 碳青霉烯酶blaNDM-1等基因檢測(cè) 145株對(duì)碳青霉烯類抗生素不敏感陰溝腸桿菌采用煮沸法提取DNA，按照表1的NDM-1引物和條件進(jìn)行blaNDM-1基因擴(kuò)增。獲取的blaNDM-1陽性菌株根據(jù)表1引物及實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行blaKPC、blaVIM、blaIMP、

blaOXA-48、blaSPM、blaGIM碳青霉烯酶基因檢測(cè)。參照文獻(xiàn) [6]條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，50 μL擴(kuò)增體系為2xTaq PCR Master Mix：25 μL，上游引物：2 μL，下游引物：2 μL，模板：2 μL，ddH2O：19 μL；PCR的反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，后95 ℃變性30 s，60 ℃退火復(fù)性30 s，72 ℃延伸1 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min；擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢驗(yàn)，將陽性條帶的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送蘇州鴻訊生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與美國(guó)生物信息中心（the National Center for Biotechnology Information，NCBI）BLAST（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行分析，判斷結(jié)果是否準(zhǔn)確。

1.2.2blaNDM-1陽性菌株改良碳青霉烯滅活試驗(yàn)（modified carbapenem inactivation method，mCIM） mCIM是一種改良的碳青霉烯酶表型檢測(cè)試驗(yàn)[7]，取1 μL接種環(huán)過夜培養(yǎng)的純菌落于2 mL TSB肉湯中，振蕩10 s，將含10 μg美羅培南的無菌紙片浸沒于TSB菌液中，35 ℃孵育4 h。孵育結(jié)束時(shí)，將0.9% NaCl溶液制備的0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊拇竽c埃細(xì)菌ATCC 25922菌懸液涂布于MH瓊脂平皿上室溫放置3～10 min，將美羅培南紙片從TSB菌液中取出，將紙片貼于涂布有大腸埃希菌ATCC 25922的MH瓊脂平皿上，35 ℃過夜培養(yǎng)。若抑菌圈直徑≤18 mm，則mCIM陽性，即待測(cè)菌株產(chǎn)碳青霉烯酶；若抑菌圈直徑≥19 mm，則不能確定是否產(chǎn)碳青霉烯酶。

1.2.3blaNDM-1陰溝腸桿菌對(duì)抗菌藥物的敏感性測(cè)定 篩選到的對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥的blaNDM-1陽性的陰溝腸桿菌采用VITEK 2-Compact 全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)進(jìn)行菌種的再次確認(rèn)和藥物敏感性試驗(yàn)，藥敏結(jié)果參照2017年CLSI推薦的折點(diǎn)進(jìn)行判讀。

1.2.4blaNDM-1陽性菌株腸桿菌基因重復(fù)一致序列（ERIC）-PCR分析 使用ERIC-PCR對(duì)受試菌進(jìn)行同源性分析。采用煮沸法提取細(xì)菌的DNA作為模板。ERIC-PCR引物序列ERIC：5'-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3'[8]。反應(yīng)體系：10×buffer 5 μL，dNTP 4 μL，Ex Taq DNA聚合酶1 μL，ERIC引物2 μL，雙蒸水37 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min變性；94 ℃ 1 min、26 ℃1 min、72 ℃ 2 min，4個(gè)循環(huán)；隨后94 ℃ 30 s、40 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，40個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳40 min后鑒定。結(jié)果判斷：同源性菌株擴(kuò)增條帶位置完全相同則具有同一ERIC基因指紋圖譜；主條帶位置相同，副條帶相差1～2條者則為亞型；不符合上述條件者則具有不同ERIC-基因指紋圖譜型，判定為非同源性菌株[9]。 所用引物見表1。

表1 PCR引物序列及擴(kuò)增片段Table 1 The PCR primer sequences and the amplilied fragments

2 結(jié)果

2.1 陰溝腸桿菌碳青霉烯酶blaNDM-1等基因的檢測(cè)

2016年1月－2017年6月分離收集的501株陰溝腸桿菌對(duì)各類抗菌藥物的敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示于表2。根據(jù)亞胺培南或美羅培南MIC≥2 mg/L，篩選出145株對(duì)碳青霉烯類抗生素不敏感的陰溝腸桿菌。經(jīng)blaNDM-1基因PCR擴(kuò)增確認(rèn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有8株細(xì)菌攜帶blaNDM-1基因，陽性檢測(cè)率為5.5%。.

8株blaNDM-1基因陽性的陰溝腸桿菌分離自7例患者，患者分布于6個(gè)臨床科室；4株分離于4例患者的清潔中段尿，2株分離于2例患者的痰液標(biāo)本，1株分離于患者糞便標(biāo)本，1株分離于患者腦脊液（術(shù)后）標(biāo)本。其中1例患者從清潔中段尿和痰液標(biāo)本中同時(shí)分離出陰溝腸桿菌YG5和YG6。

表2 2016年1月－2017年6月檢出陰溝腸桿菌藥敏結(jié)果Table 2 Susceptibility of the Enterobacter cloacae strains during the period from January 2016 to June 2017（%）

8株blaNDM-1基因檢測(cè)陽性的陰溝腸桿菌PCR電泳結(jié)果見圖1，8株細(xì)菌均有明顯的blaNDM-1基因擴(kuò)增陽性條帶。其擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)蘇州鴻訊生物科技有限公司測(cè)序驗(yàn)證皆為blaNDM-1基因。

圖1 blaNDM-1基因陽性陰溝腸桿菌PCR電泳結(jié)果Figure 1 Electrophoretic results after PCR amplification of blaNDM-1 gene in 8 Enterobacter cloacae strains

隨后對(duì)這8株blaNDM-1基因陽性的陰溝腸桿菌進(jìn)行blaKPC、blaVIM、blaIMP、blaOXA-48、blaSPM、blaGIM基因檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)其同時(shí)攜帶其他碳青霉烯酶耐藥基因。

2.2 blaNDM-1陽性菌株mCIM碳青霉烯酶表型試驗(yàn)

8株blaNDM-1基因陽性陰溝腸桿菌進(jìn)行mCIM，結(jié)果顯示美羅培南的抑菌圈皆小于18 mm，mCIM全部陽性。見圖2。

2.3 blaNDM-1陽性陰溝腸桿菌對(duì)抗菌藥物的敏感性

采用VITEK 2-Compact 全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)進(jìn)行菌株體外藥物敏感性試驗(yàn)。結(jié)果見表3。8株blaNDM-1陽性陰溝腸桿菌對(duì)碳青霉烯類、頭孢菌素類和青霉素類等抗生素普遍耐藥，但個(gè)別菌株 對(duì)四環(huán)素和阿米卡星敏感。

圖2 blaNDM-1陽性菌株碳青霉烯酶表型結(jié)果圖Figure 2 Phenotypic testing of carbapenemases in blaNDM-1 positive strain

表3 8株blaNDM-1陽性陰溝腸桿菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 3 MICs of various antimicrobial agents against 8 strains of blaNDM-1-positive Enterobacter cloacae（mg/L）

2.4 blaNDM-1陽性菌株ERIC-PCR同源性分析結(jié)果

ERIC-PCR電泳結(jié)果將8株blaNDM-1基因陽性陰溝腸桿菌大致分為4種不同類別的指紋圖譜（A～D），A型3株（YG4、YG7和YG8）；B型（YG1與YG2）和C型（YG5與YG6）各為2株；D型只有1株YG3。ERIC-PCR電泳結(jié)果見圖3。

圖3 8株blaNDM-1陽性陰溝腸桿菌的ERIC-PCR結(jié)果Figure 3 ERIC-PCR typing results of 8 strains of blaNDM-1-positive Enterobacter cloacae

3 討論

隨著抗生素的廣泛使用，造成的細(xì)菌耐藥問題已經(jīng)引起了全球?qū)W者的高度關(guān)注，尤其是碳青霉烯類抗生素監(jiān)管不力及不合理應(yīng)用所造成的革蘭陰性桿菌的耐藥現(xiàn)象已經(jīng)越來越普遍。陰溝腸桿菌是造成臨床感染的常見革蘭陰性桿菌之一，現(xiàn)今臨床上產(chǎn)碳青霉烯酶的陰溝腸桿菌也日益增多，其引起的感染多為難治性的重癥感染[12-13]。本研究在我院145株對(duì)碳青霉烯類抗生素不敏感的陰溝腸桿菌中檢出8株攜帶blaNDM-1基因，blaNDM-1基因陽性率為5.5%（8/145），未發(fā)現(xiàn)其同時(shí)攜帶blaKPC、blaVIM、blaIMP、blaOXA-48、blaSPM、blaGIM碳青霉烯酶耐藥基因。這是江西省近年發(fā)現(xiàn)攜帶blaNDM-1基因陰溝腸桿菌最多的一次，雖然該類菌株未造成嚴(yán)重的感染性事件，但是攜帶blaNDM-1基因產(chǎn)生的碳青霉烯酶造成以碳青霉烯類抗生素耐藥為主的多重耐藥問題給臨床帶來了很大的治療困難。

8株blaNDM-1基因陽性陰溝腸桿菌的藥敏結(jié)果顯示均為多重耐藥菌株，尤其對(duì)碳青霉烯類、頭孢菌素類和青霉素類抗生素的耐藥率非常高，對(duì)四環(huán)素和阿米卡星的耐藥率相對(duì)較低，這與其他文獻(xiàn)報(bào)道基本相似[14-15]。造成如此耐藥現(xiàn)狀可能與臨床過度使用碳青霉烯類、頭孢菌素類和青霉素類抗生素有關(guān)。

對(duì)碳青霉烯酶的表型檢測(cè)以往都是運(yùn)用改良Hodge試驗(yàn)，其檢測(cè)KPC型A類碳青霉烯酶和OXA型D類碳青霉烯酶有良好的效果，但是對(duì)金屬酶IMP、VIM和NDM-1檢測(cè)效率不高[16]，為了提高B類金屬β內(nèi)酰胺酶的檢出率往往聯(lián)合針對(duì)B類碳青霉烯酶的EDTA雙紙片協(xié)同試驗(yàn)，這加大了試驗(yàn)成本和操作難度。本研究運(yùn)用新型的mCIM，能夠檢測(cè)所有主要的碳青霉烯酶[17]，本次8株攜帶blaNDM-1基因的陰溝腸桿菌mCIM試驗(yàn)全部陽性，結(jié)合blaNDM-1基因分析，提示該8株陰溝腸桿菌全部產(chǎn)B類碳青霉烯酶，且為NDM-1型金屬酶。

ERIC-PCR是一種簡(jiǎn)單、快速、便捷的基因分型技術(shù)，適合同源性初步篩查，本次ERIC-PCR結(jié)果將8株blaNDM-1基因初步分為4個(gè)不同類別的基因指紋圖譜型，其中部分菌株的同源性非常高，說明我院產(chǎn)NDM-1酶的陰溝腸桿菌存在部分的克隆傳播現(xiàn)象。

在全球范圍內(nèi)blaNDM-1基因常由腸桿菌科細(xì)菌攜帶，數(shù)目最多的是肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌[18-20]。本次研究在對(duì)碳青霉烯類抗生素不敏感的陰溝腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了8株攜帶blaNDM-1基因菌株，且多為以碳青霉烯類抗生素耐藥為主的多重耐藥株。而以往少見的耐藥腸桿菌科細(xì)菌成為現(xiàn)今臨床常見的造成嚴(yán)重感染的耐藥菌種之一。為避免耐藥細(xì)菌的不斷增多及耐藥譜的擴(kuò)大，醫(yī)院臨床科室及有關(guān)防控部門應(yīng)當(dāng)引起重視，建立有效的監(jiān)測(cè)體系和防控措施，遏制細(xì)菌耐藥不斷增長(zhǎng)的趨勢(shì)，避免造成不良后果。