石斛合劑序貫法治療糖尿病合并肝損傷的作用機制

蕭自智 ，施 紅 ，饒煥文 ，羅麗芬

（1.福建中醫藥大學中西醫結合學院，福建 福州 350122；2.羅麗芬集團嘉文麗化妝品技術中心，福建 漳州 363000）

我國糖尿病人數已達 1.096億，居全球首位，其中 2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）占90%～95%［1］。而 T2DM患者中非酒精性脂肪肝（non-alcohol fatty liver disease，NAFLD）的患病率為60%～80%［2］。T2DM合并NAFLD是一種代謝性疾病，往往與患者高脂高糖飲食有關［3］。高脂高糖飲食可以引起生物體內高活性分子如活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）產生過多或消除減少，Kupffer細胞被激活并釋放大量炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1 等［4］，導致肝組織細胞損傷［5］。選定由石斛、黃芪、知母、生地黃、丹參、地龍、葛根、五味子等組成滋陰清熱、益氣生津、活血化瘀的石斛合劑1方，選定由茵陳、梔子、大黃、萹蓄、滑石、甘草等組成清瀉濁毒的石斛合劑2方，臨床上先以石斛合劑1方，繼以石斛合劑2方，隨之再返回1方，如此循環，形成石斛合劑序貫法（the dendrobium mixture in order cycle method，DMOC），并且發現 DMOC 治療T2DM合并NAFLD療效較好，但是對其作用機制研究較少。為此，本研究通過構建高成模率和高穩定性的糖尿病大鼠模型，探討DMOC治療糖尿病合并肝損傷的作用機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 40只健康清潔級雄性Sprague-Dawley 大鼠［許可證號：SCXK（滬）2012—0002］，5周齡，體質量（180±10）g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供。大鼠飼養條件為12 h白晝、12 h黑夜自動光照控制25℃、相對濕度55%的室溫控制，給予自來水及標準嚙齒類飼料自由飲水及進食，經1周的適應期后開始實驗。大鼠飼料成分由國外動物飼料Dyets公司提供（見表 1、2），動物實驗通過臺灣弘光科技大學實驗動物照護及使用委員會審查（同意書編號10405，計劃執行期間2015年9月—2016年8月）。

表1 大鼠飼料成分組成g／kg

表2 大鼠飼料能量組成Kcal／g

1.2 實驗藥物 DMOC 1方（石斛15 g，黃芪21 g，知母 12 g，生地黃 15 g，丹參 18 g，地龍 15 g，葛根15 g，五味子 9 g，共計 120 g）、DMOC 2 方（茵陳 18 g，梔子 12 g，大黃 6 g，萹蓄 15 g，滑石 15 g，甘草 6 g，共計72 g）購自福建中醫藥大學附設國醫堂。DMOC 1方和DMOC 2方均以常規水煎2次后合并、過濾、濃縮成 100 mL藥液，DMOC 1、2方的含藥量分別為 1.2、0.72 g／mL。

1.3 實驗試劑與儀器 鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）（美國 Sigma公司）；ELx800酶標儀（美國 Bio-TEK公司）；55I尼康生物顯微鏡（日本尼康公司）；DSC-N158A臺式離心機（臺灣歐米克斯公司）。

2 實驗方法

2.1 動物模型的建立與干預 采用隨機數字表法將大鼠分成正常組、正常干預組、模型組和模型干預組，每組10只。正常組和正常干預組予以基本飼料喂養。模型組和模型干預組予以高脂高糖飼料喂養 4 周后，以腹腔注射 2 次 STZ 25 mg／（kg·m2），間隔72 h加以誘導，注射后第4天，用血糖測定儀測量血糖，篩選空腹血糖＞11.1 mmol／L為糖尿病造模成功大鼠。飲食處理后出現高血糖、高血脂、肝功能異常現象，表明糖尿病合并肝損傷大鼠造模成功。喂養至第36～44周，正常干預組和模型干預組進行DMOC中藥干預。根據體重計算灌胃量，每只實驗大鼠的灌胃量參考文獻［6］進行換算，臨床上成人 1 包 ／（60 kg·d），每包100 mL，相當于大鼠 0.05包／（0.5 kg·d），每包 5 mL。

2.2 組織取材與處理 實驗期間大鼠進行采血檢驗分析，實驗結束以二氧化碳對大鼠施行安樂死，組織取材保存于-80℃備用并進行肝活檢。

2.3 觀測指標及方法 觀察每組大鼠的體質量、肝組織重量、腹腔脂肪重量。葡萄糖氧化酶法檢測空腹血糖（FBG）；紫外分光比色法檢測 TC、TG、AST、ALT；DCF法檢測活性氧簇（ROS）；酶聯免疫吸附測定法檢測TNF-α、IL-6；HE染色法觀察肝臟組織形態學變化。

2.4 統計學方法 采用SPSS 19.0統計軟件進行分析處理。符合正態分布的計量資料以（s）表示，采用單因素方差分析。

3 結 果

3.1 4組大鼠體質量、肝組織重量、腹腔脂肪重量比較 見表3。

表3 4組大鼠體質量、肝組織重量、腹腔脂肪重量比較（s）

表3 4組大鼠體質量、肝組織重量、腹腔脂肪重量比較（s）

注：與正常組比較，1） P＜0.01，2） P＜0.05；與模型組比較，3） P＜0.01，4） P＜0.05。

腹腔脂肪重量／g 36.99±4.80 28.17±2.80 93.90±21.401）73.30±16.004）組別正常組正常干預組模型組模型干預組n 10 10 10 10體質量／g 626.00±50.10 586.70±31.50 781.70±114.901）654.80±51.304）肝組織重量／g 16.11±2.00 16.24±2.90 19.08±2.402）16.05±1.303）

3.2 4組大鼠血清血糖、血脂、肝功能指標比較見表4。

表4 4組大鼠血清血糖、血脂、肝功能指標比較（±s）

表4 4組大鼠血清血糖、血脂、肝功能指標比較（±s）

注：與正常組比較，1） P＜0.01；與模型組比較，2） P＜0.01，3） P＜0.05。

TG／（mmol／L）1.06±0.21 1.03±0.23 1.83±0.531）1.18±0.232）組別正常組正常干預組模型組模型干預組n 10 10 10 10 FBG／（mmol／L）5.25±0.12 4.63±1.91 14.99±3.951）9.57±2.872）TC／（mmol／L）1.83±0.35 2.06±0.41 2.82±0.551）2.26±0.233）AST ／（U／L）83.67±5.20 83.13±19.80 145.00±34.661）103.00±22.413）ALT／（U／L）35.50±10.33 37.63±14.04 113.33±37.451）91.29±13.88

3.3 大鼠肝組織形態學觀察 正常組與正常干預組肝細胞大小均勻，肝小葉結構正常且肝索排列整齊，表明DMOC本身不會造成肝細胞毒性。模型組肝細胞呈空泡狀變性，肝組織脂肪堆積明顯，細胞間質增厚，纖維組織增粗，肝小葉結構破壞明顯，中央靜脈周圍伴匯管區有炎性細胞浸潤等情形；與模型組相比，模型干預組肝細胞壞死、炎性細胞浸潤程度明顯減少，表明DMOC具有改善糖尿病大鼠肝損傷的作用。見圖1。

圖1 4組大鼠肝組織HE染色圖（×200）

3.4 4組大鼠血清ROS、TNF-α、IL-6變化比較見表5。

表 5 4 組大鼠血清 ROS、TNF-α、IL-6 變化比較（s）

表 5 4 組大鼠血清 ROS、TNF-α、IL-6 變化比較（s）

注：與正常組比較，1） P＜0.01；與模型組比較，2） P＜0.01。

IL-6／（pg／mL）95.80±12.41 91.57±8.73 1906.07±211.171）592.11±5.762）組別正常組正常干預組模型組模型干預組n 10 10 10 10 ROS ／（nmol DCF ／min ／mg protein）51.48±5.52 52.65±7.14 357.75±50.591）165.70±22.972）TNF-α／（ng／mL）6.40±0.84 6.46±0.88 118.13±11.111）54.83±5.372）

4 討論

T2DM發生胰島素抵抗導致肝臟脂質沉積，從而促進NAFLD的發生。以氧化應激和脂質過氧化為中心的“二次打擊”學說認為：當脂肪細胞內活性氧的產生超過抗氧化系統的清除能力時，便產生氧化應激引起ROS產生，導致脂質過氧化損傷，致使Kupffer細胞激活并釋放 TNF-α、IL-6、IL-1等炎性細胞因子和遞質，進而引起細胞浸潤、變性或壞死，最終造成肝損傷形成NAFLD。

糖尿病合并脂肪肝的大鼠造模是一種雙疾病動物模型，近年來國內外學者利用大鼠建立糖尿病合并脂肪肝的病理模型進行大量研究［7］。本課題組基于脂肪肝造模的優缺點，最后決定采用雄性SD大鼠造模，實驗時間延長為36周以符合人類30歲的年齡［8］，高脂高糖飲食的成分組成參考國外動物飼料Dyets公司配方，模型組脂肪和總能量的實際攝入量明顯高于正常組，并在預實驗36周后活檢觀察到肝損傷后再進行中藥干預。

在動物模型的研究中，血糖是觀察糖尿病和藥物治療的最主要指標。血脂分析的重要指標TC是指血液中脂蛋白所含膽固醇的總和，TG是人體主要的能量儲存單元，生命活力的重要來源，血清中持續的高濃度TG可導致肝細胞中脂肪過度堆積而引起脂肪肝病變。血清AST、ALT是肝細胞重要的酶，AST、ALT及AST／ALT比值是糖尿病合并脂肪肝的相對敏感指標，可反映肝纖維化、肝硬化的發展。正常完整的肝細胞膜中AST及ALT不會溢流到肝細胞外，但肝細胞本身受到某些因素的傷害后，使得肝細胞中所含的AST及ALT釋放到血液中呈異常增加。

動物實驗中還發現：大鼠予以高脂高糖飲食后，內臟的脂肪細胞增生肥大可誘導肝臟炎性浸潤反應、脂肪變性壞死及肝纖維化，同時K upffer細胞釋放大量炎性因子TNF-α、IL-6，隨著病變的進展，炎性細胞和巨噬細胞將在肝細胞內不斷增加，促進肝細胞內的氧化應激反應，ROS產生過多或消除減少，從而促進肝星狀細胞激活、轉化和合成細胞外基質，最終誘發進展性肝纖維化或肝細胞凋亡。檢測ROS、TNF-α、IL-6水平可以用來判斷糖尿病合并肝損傷的嚴重程度。

臨床經驗中用于治療T2DM合并NAFLD的中藥少見。石斛合劑序貫法是根據施紅教授［9］提出的“糖尿病氣陰兩虛血瘀貫穿始終，伴階段性痰、濕、熱以及濁毒不祛，氣陰難補”的觀點，根據滋陰清熱、益氣生津、活血化瘀、清瀉濁毒治則對糖尿病及其并發癥進行治療，DMOC包含2個方劑（1方、2方），臨床上先以DMOC 1方滋陰清熱、益氣活血、補益脾腎，并隨證加減，扶正為主，7劑左右；繼以DMOC 2方清肝利濕泄濁，3劑，中病即止；隨之再返回1方，如此循環，臨床應用效果較好。本文的動物實驗結果也表明：石斛合劑能改善糖尿病合并肝損傷大鼠的 FBG、TC、TG、AST、ROS、TNF-α、IL-6，以及改善大鼠的肝組織泡沫樣變、細胞腫脹、界線不清、肝竇狹窄、中央靜脈周圍伴匯管區淋巴細胞浸潤。此外，為了觀察石斛合劑是否對肝臟具有毒性作用，本文在實驗設計上增設了正常干預組，結果顯示在肝功能及肝活檢方面，石斛合劑不具肝細胞毒性。關于石斛合劑序貫法治療糖尿病合并肝損傷大鼠的具體機制及安全性有待進一步研究。