LC-MS／MS法同時測定益氣補血口服液中4個成分的含量

張敏新 ，王書林 ，余宇燕

（1.福建中醫藥大學藥學院，福建 福州 350122；2.南京軍區福州總醫院，福建 福州 350025）

益氣補血湯是我院中醫科專家長期在臨床使用的驗方，本處方主要由黃芪、當歸等8味中藥組成，具有益氣生血、補腎填精，促進因放化療引起的骨髓功能損傷的修復及調整機體免疫的功效。適用于放、化療后白細胞減少，貧血及免疫功能低下者［1］。臨床驗證表明該方療效顯著，安全性好。為了提高患者的順應性，將其制成口服液，使其更便于服用、保存、運輸。本研究采用高效液相色譜-質譜聯用技術（LC-MS／MS），通過多反應離子監測（multiple reaction monitoring，MRM）對處方中的君藥黃芪、當歸及臣藥白芍、淫羊藿中的淫羊藿苷、芍藥苷、阿魏酸和黃芪甲苷等4個成分同時進行含量測定。本方法具有檢測時間短、分離度好的特點，亦可以避免性質相近的化學成分相互干擾，且 LC-MS／MS檢測靈敏度高，不受化合物生色基團的限制，更適于中藥樣品中多組分的同時測定［2-3］。本方法的建立可為益氣補血口服液的質量控制提供參考，提高高效液相色譜方法的檢測效率，縮短分析時間。

1 儀器與試藥

1.1 實驗試藥 黃芪甲苷（110781-201314，含量測定用）、淫羊藿苷（110737-200415，含量測定用）、芍藥苷（110736-201337，含量測定用）、阿魏酸（110773-201313，含量測定用）均購自中國食品藥品檢定研究院；益氣補血口服液及其陰性口服液均為自制；甲醇、乙腈（色譜純，美國 Fisher公司）、95%乙醇（醫用酒精，山東利爾康醫療科技股份有限公司）；甲酸、乙酸銨（色譜純，迪馬科技）。

1.2 實驗儀器 島津30A液相色譜儀［LC-30AD二元泵、SIL-30AC自動進樣器、CTO-20A柱溫箱，島津企業管理（中國）有限公司］；AB Sciex Qtrap 5500三重四極桿質譜儀（美國AB公司）；KQ-800KDE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DC215CD十萬分之一電子天平、SE6001F電子天平［奧豪斯儀器（上海）有限公司］，RE-5203旋轉蒸發儀（上海亞榮公司）。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品儲備液 分別取芍藥苷、阿魏酸、淫羊藿苷和黃芪甲苷對照品適量，精密稱定，以70%甲醇水溶解并分別制成含芍藥苷102.4μg／mL、阿魏酸 108.0 μg／mL、淫羊藿苷 282.9 μg／mL 和黃芪甲苷105.9μg／mL儲備液，搖勻，即得。

2.1.2 供試品溶液制備 精密吸取樣品溶液5.0 mL，置于25 mL量瓶中，加70%甲醇水約10 mL，超聲處理5 min，放至室溫，以70%甲醇水稀釋至刻度，搖勻，0.22μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.1.3 陰性樣品溶液 按益氣補血口服液制備工藝，分別制備缺白芍、黃芪、淫羊藿及同時缺當歸和黨參的陰性溶液。按照“2.1.2”項方法制備各陰性對照溶液，即得。

2.2 色譜-質譜條件色譜條件 色譜條件：采用phenomenex Kinetex C18色譜柱（4.6 mm×100 mm，2.6 μm），柱溫 40 ℃，以乙腈-0.2%甲酸、1 mmol／L乙酸銨水溶液為流動相，梯度洗脫（0～1 min，30%乙腈；1～10 min，30%乙腈→70%乙腈），流速 0.4 mL／min，進樣量5μL。質譜條件：采用電噴霧離子源（ESI），氣簾氣壓力 20.0 psi，加熱氣溫度為 550℃，輔助氣壓力60.0 psi，霧化氣壓力55.0 psi，電壓為5 500 V（正離子模式）、-4 500 V（負離子模式）。芍藥苷、阿魏酸、淫羊藿苷以負離子掃描方式，黃芪甲苷以正離子掃描方式MRM模式，4個主要成分的質譜參數見下表 1，供試品及陰性樣品的總離子流圖譜見圖 1。

表1 4個分析物的質譜參數

圖1 混合對照品（A）、供試品（B）、缺白芍陰性樣品（C）、缺當歸陰性樣品（D）、缺淫羊藿陰性樣品（E）、缺黃芪陰性樣品（F）總離子流圖

2.3 線性關系考察 取對照品儲備液適量，加70%甲醇水稀釋制成系列濃度的混合對照品溶液，進樣，測定。以對照品質量濃度（X）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標，進行線性回歸，得到線性回歸方程及相關系數，結果表明 4個成分在相應的范圍內線性關系良好，見表 2。

表2 各成分線性關系

2.4 精密度試驗 制備中間濃度混合對照品溶液，連續進樣6次，測得芍藥苷、阿魏酸、淫羊藿苷、黃芪甲苷峰面積的RSD分別為1.89%、0.86%、1.45%和4.84%，表明儀器的精密度良好。

2.5 重復性試驗 按“2.1.2”項下方法制備同一批樣品（批號180110）的供試品溶液 6份，進樣測定。結果芍藥苷、阿魏酸、淫羊藿苷、黃芪甲苷的平均含量分別為 1.93、0.25、0.66、0.13 mg／mL，RSD 分別為4.7%、4.0%、2.2%、4.4%，表明本方法的重復性良好。

2.6 穩定性試驗 取“2.1.2”項下同一份供試品溶液，分別于 0、2、4、8、12 h 進樣測定，測得芍藥苷、阿魏酸、淫羊藿苷、黃芪甲苷峰面積的RSD分別為2.31%、1.14%、1.53%、4.10%，表明供試品溶液在12 h內穩定性良好。

2.7 加樣回收率試驗 精密吸取同一已知含量的益氣補血口服液（批號180110）9份，每份5.0 mL，分別置于50 mL量瓶中，精密加入各對照品儲備液適量，使高、中、低濃度對照品加入量與所取供試品中待測定成分量之比控制在 1.5∶1、1∶1 和 0.5∶1［4］，按“2.1.2”項方法制備供試溶液，進樣測定，計算回收率，見表3。

表3 加樣回收率試驗（n＝9）

2.8 樣品測定 取3批次益氣補血口服液樣品，按照“2.1.2”項方法制備供試品溶液，進樣測定其含量，見表4。

表4 各成分含量測定結果mg／mL

3 討論

3.1 檢測方法的選擇 芍藥苷［5］、阿魏酸［5］由于極性較大，中藥復方制劑中極性成分往往相對較多，各成分之間的干擾大，完全分離相對較難。筆者曾以乙腈-0.1%磷酸溶液（10∶90）為流動相，色譜柱填充劑 Hypersil ODS2（4.6 mm×250 mm，5 μm），流速為1.0 mL／min，結果發現芍藥苷在相對保留時間為15.1 min時，仍未能有效分離，再加上阿魏酸、淫羊藿苷、黃芪甲苷等成分，單個樣品的分析時間需要約100 min左右，分析時間較長且分離效果不理想、前處理過程較復雜［5］。采用液-質聯用，以MRM 方式測定，有效避免其他成分的干擾，專屬性更高［6］，可以準確測定樣品中芍藥苷、阿魏酸、淫羊藿苷、黃芪甲苷的含量。

3.2 芍藥苷質譜條件的考察 芍藥苷在ESI＋模式下， 可產生 m／z 481.2→463.1，319.2，301.1，197.1，178.9等碎片離子，其中以m／z 301.1的碎片離子豐度較高，前期選擇了m／z 481.2→301.1作為離子對進行MRM分析，結果發現在其色譜峰前面出現較大的干擾峰，且分離較為困難，故又以ESI－模式進行參數優化，發現其可產生 m／z 479.1→449.0，357.2，327.0，121.0等碎片離子，其中以m／z 449.0的碎片離子豐度較高，但由于芍藥苷在樣品中含量相對較高，如果樣品稀釋倍數過大，其他成分的含量就相對偏低，故最終選擇相對豐度較低的離子對m／z 479.1→357.2為其定量離子對。

3.3 阿魏酸質譜條件的考察 阿魏酸在ESI＋模式下，可產生 m／z 195.1→176.9等碎片離子，但同樣由于其含量相對較高，稀釋倍數小時，其色譜峰為平頭峰，故最終選擇在ESI－模式下檢測，以m／z 194.0→150.1為其定量離子對。

3.4 流動相的選擇 由于芍藥苷、阿魏酸、淫羊藿苷等在酸性流動相中，峰形較好，故選擇在水相中加入少量的甲酸。但黃芪甲苷在水及甲酸溶液中易產生加Na峰（m／z 807.4），故在流動相中加入適量的乙酸銨以抑制其加Na峰的產生。

本實驗建立LC-MS／MS法同時測定益氣補血口服液中芍藥苷、阿魏酸、淫羊藿苷和黃芪甲苷4個成分的含量，該方法簡便、快捷，靈敏度高，專屬性好，可用于益氣補血口服液的質量控制。LC-MS／MS法已逐漸成為中藥及中藥復方制劑多成分同時測定的較佳方法［7］。