獨活寄生湯含藥血清對退變軟骨細胞PERK／Bip通路關鍵調控蛋白的影響

陳 俊 ，許惠鳳 ，鄭春松 ，葉錦霞 ，陳振沅 ，邱建清 ，劉淑如 ，劉獻祥 ，吳廣文

（1.福建中醫藥大學中西醫結合學院，福建 福州 350122；2.福建省中西醫結合老年性疾病重點實驗室，福建 福州 350122）

膝骨關節炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種多見于中老年人的退行性關節疾病，發病率隨年齡而增加［1］，易反復發作、纏綿難愈，具有較高的致殘率［2－3］，其防治已成為醫學界研究的難點問題之一。獨活寄生湯長期應用于治療KOA，療效顯著［4-7］。前期研究表明獨活寄生湯通過抑制軟骨基質主要成分丟失，有效減輕KOA大鼠關節軟骨基質破壞［8］；通過激活G蛋白偶聯信號傳導通路抑制軟骨基質降解，修復受損的軟骨組織［9］；有效抑制軟骨細胞凋亡［10］，但是否通過調節蛋白激酶R樣內質網激酶（protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）／免疫球蛋白結合蛋白（immunoglobulin-binding protein，BiP）信號通路，尚不明確。本實驗進一步觀察獨活寄生湯含藥血清對大鼠退變軟骨細胞PERK／Bip信號通路關鍵調控因子PERK、Bip、真核細胞翻譯起始因子-2α（eukaryotic initiation factor 2α，eIF-2α）、轉錄激活因子-4（activating transcription factor 4，ATF-4）、生長抑制 DNA損傷基因153抗原（growth arrest and DNA damage-inducible 153，GADD153）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（cysteine containing aspartate specific protease，Caspase）-9、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（cysteine containing aspartate specific protease，Caspase）-3 蛋白的影響，探討獨活寄生湯抑制軟骨細胞凋亡的作用機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 36只2月齡和20只4周齡清潔級雄性SD大鼠，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司［SCXK（滬）2012-0002］。

1.2 實驗藥物 獨活寄生湯的組成藥物均購于福建中醫藥大學附屬第二人民醫院藥劑科。

1.3 實驗試劑 DMEM培養基（美國Hyclone公司）；胎牛血清（美國GIBCO公司）；0.25%胰蛋白酶（美國Hyclone公司）；Ⅱ型膠原酶粉末（美國Sigma公司）；Bip、eIF-2α、ATF-4、GADD153 和 Caspase-3一抗（美國 abcam公司）；Caspase-9一抗（美國Thermo Fisher Scientific公司）；PERK 一抗、二抗（美國Cell Signaling Technology公司）。

1.4 實驗儀器 蛋白核酸分析儀（美國Beckman Coulter公司）；化學發光成像系統ChemiDocXRS+（美國Bio-Rad公司）。

2 實驗方法

2.1 含藥血清和空白血清的制備 36只2月齡SD大鼠，隨機分為含藥血清組和空白血清組2組，18只／組。根據臨床等效劑量換算［11］，含藥血清組按照 9.3 g／（kg·d）的劑量灌服獨活寄生湯，空白血清組按照10 mL／（kg·d）的劑量灌服0.9%生理鹽水，連續灌胃7 d后，麻醉后行腹主動脈采血，離心獲取上層血清，56℃水浴滅活30 min，-20℃保存備用。

2.2 細胞模型的復制和藥物干預 參照課題組前期取材方法，將4周齡大鼠用75%酒精浸泡5 min，無菌條件下游離并截取膝關節，置入無菌培養皿，帶入超凈工作臺操作。先用PBS充分漂洗，刮除關節周圍附著的肌肉、脂肪等組織后用PBS充分漂洗。用刀片削取每個關節表面的軟骨，PBS充分漂洗軟骨小塊3次，采用酶消化法，消化、獲取正常軟骨細胞［12］，培養、傳代至第三代，再予 10 ng／mL IL-1β誘導24 h，獲得退變軟骨細胞［13-14］。含藥血清和空白血清分別干預24、48和72 h后，檢測相關指標。

2.3 Western Blot法檢測退變軟骨細胞蛋白表達血清干預結束后，提取退變軟骨細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，Western Blot法檢測PERK、Bip、eIF-2α、ATF-4、GADD153、Caspase-9 和 Caspase-3蛋白表達情況，抗體稀釋倍數如下：PERK（1∶1 000）、Bip（1∶5 000）、eIF-2α（1∶2 500）、ATF-4（1∶1 000）、GADD153（1∶2 500）、Caspase-9（1∶300）和 Caspase-3（1∶500）。

2.4 統計學方法 采用SPSS 22.0軟件進行數據分析。計量資料符合正態分布的采用（±s）進行描述。2組間比較采用重復測量方差分析；同一時間點2組間比較使用Multivariate分析。

3 結果

3.1 血清干預退變軟骨細胞蛋白電泳結果 見圖1。

圖1 血清干預退變軟骨細胞蛋白電泳圖

3.2 血清對退變軟骨細胞蛋白表達的影響 見表1～7。

表1 2組退變軟骨細胞中PERK蛋白含量比較（s）

表1 2組退變軟骨細胞中PERK蛋白含量比較（s）

注：1）主效應的F值和P值；2）交互效應的F值和P值。

組別空白血清組含藥血清組F值P值干預24 h 0.312±0.006 0.228±0.038 14.008 0.020干預48 h 0.227±0.037 0.160±0.018 7.808 0.049干預72 h 0.189±0.037 0.113±0.021 9.293 0.038 F值30.820 55.768 77.0041）0.3812）P值0.013 0.004 0.0001）0.6382）

表2 2組退變軟骨細胞中Bip蛋白含量比較（±s）

表2 2組退變軟骨細胞中Bip蛋白含量比較（±s）

注：1）主效應的F值和P值；2）交互效應的F值和P值。

組別空白血清組含藥血清組F值P值干預24 h 0.696±0.059 0.503±0.051 18.368 0.013干預48 h 0.536±0.043 0.364±0.055 18.015 0.013干預72 h 0.476±0.041 0.224±0.106 14.590 0.019 F值77.185 47.739 109.6441）3.0042）P值0.012 0.008 0.0001）0.1382）

表3 2組退變軟骨細胞中eIF-2α蛋白含量比較（±s）

表3 2組退變軟骨細胞中eIF-2α蛋白含量比較（±s）

注：1）主效應的F值和P值；2）交互效應的F值和P值。

組別空白血清組含藥血清組F值P值干預24 h 0.391±0.042 0.250±0.042 16.876 0.015干預48 h 0.309±0.032 0.127±0.010 89.436 0.001干預72 h 0.227±0.064 0.071±0.022 16.069 0.016 F值14.513 26.219 38.0631）0.5602）P值0.039 0.020 0.0001）0.5802）

表4 2組退變軟骨細胞中ATF-4蛋白含量比較（±s）

表4 2組退變軟骨細胞中ATF-4蛋白含量比較（±s）

注：1）主效應的F值和P值；2）交互效應的F值和P值。

組別空白血清組含藥血清組F值P值干預24 h 0.851±0.075 0.632±0.099 9.420 0.037干預48 h 0.696±0.085 0.494±0.064 10.724 0.031干預72 h 0.544±0.087 0.389±0.035 8.251 0.045 F值31.726 19.662 50.5691）0.7322）P值0.022 0.033 0.0011）0.4672）

表5 2組退變軟骨細胞中GADD153蛋白含量比較（s）

表5 2組退變軟骨細胞中GADD153蛋白含量比較（s）

注：1）主效應的F值和P值；2）交互效應的F值和P值。

組別空白血清組含藥血清組F值P值干預24 h 0.638±0.059 0.446±0.080 11.192 0.029干預48 h 0.501±0.038 0.294±0.080 16.298 0.016干預72 h 0.436±0.080 0.226±0.044 15.773 0.017 F值15.375 31.152 42.3151）0.0792）P值0.035 0.008 0.0001）0.9052）

表6 2組退變軟骨細胞中Caspase-9蛋白含量比較（±s）

表6 2組退變軟骨細胞中Caspase-9蛋白含量比較（±s）

注：1）主效應的F值和P值；2）交互效應的F值和P值。

組別空白血清組含藥血清組F值P值干預24 h 0.458±0.016 0.354±0.059 8.848 0.041干預48 h 0.357±0.051 0.189±0.081 9.141 0.039干預72 h 0.212±0.030 0.110±0.056 7.832 0.049 F值123.452 150.302 265.0941）6.1632）P值0.005 0.002 0.0001）0.0402）

表7 2組退變軟骨細胞中Caspase-3蛋白含量比較（±s）

表7 2組退變軟骨細胞中Caspase-3蛋白含量比較（±s）

注：1）主效應的F值和P值；2）交互效應的F值和P值。

組別空白血清組含藥血清組F值P值干預24 h 0.580±0.066 0.420±0.025 15.326 0.017干預48 h 0.474±0.063 0.342±0.038 9.667 0.036干預72 h 0.395±0.046 0.208±0.058 19.352 0.012 F值53.426 22.944 59.5061）1.1772）P值0.013 0.038 0.0011）0.3432）

4 討論

KOA是在多種因素共同作用下，軟骨細胞、細胞外基質、軟骨下骨三者降解和合成正常偶聯失衡的結果［15］，是常見的骨關節疾病之一［16］。 細胞凋亡是關節軟骨細胞的中心性特征，是關節軟骨退行性改變的病理因素之一［17-18］。研究表明內質網應激反應與軟骨細胞凋亡密切相關［19］，PERK／Bip 信號通路則是調控內質網應激反應引起軟骨細胞凋亡的關鍵通路［20-21］。PERK信號分子的激活可以磷酸化eIF-2α，后者可激活ATF-4，上調 GADDl53表達，GADDl53則抑制Bcl-2的表達，導致Bcl-2／bax比例失衡，引起Caspase-9激活，活化的Caspase-9再激活 Caspase-3，從而啟動細胞的凋亡程序［22-24］。

KOA屬中醫“痹證”“痿證”范疇，氣血營衛虧虛是致病內因，風寒濕邪外襲是致病外因。獨活寄生湯中獨活祛下焦與筋骨間的風寒濕邪，為君藥。細辛散陰經風寒，搜筋骨風濕，通絡止痛；秦艽除風濕舒筋；肉桂心溫里祛寒，通利血脈，均為臣藥。桑寄生、牛膝、杜仲補肝腎，壯筋骨，祛風濕；當歸、川芎、地黃、芍藥養血活血；人參、茯苓、甘草補氣健脾，扶助正氣，均為佐藥。甘草調和諸藥，為使藥。諸藥合用，祛邪扶正，標本兼顧，最終達到祛風濕、止痹痛、益肝腎、補氣血之功，能針對KOA病機，起治療作用［25-26］。

為了進一步闡明獨活寄生湯含藥血清抑制退變軟骨細胞凋亡的機制，本研究采用Western Blot法檢測PERK／Bip信號通路中關鍵調節因子PERK、Bip、eIF-2α、ATF-4、GADD153、Caspase-9、Caspase-3蛋白表達，結果發現隨著干預時間的延長，空白血清 組 和 含 藥 血 清 組 PERK、Bip、eIF-2α、ATF-4、GADD153、Caspase-9、Caspase-3 蛋白表達量均逐漸降低，以含藥血清組降低更為明顯，表明空白血清組和含藥血清組均可時間依賴性地降低PERK、Bip、eIF-2α、ATF-4、GADD153、Caspase-9、Caspase-3表達，且含藥血清組效果優于空白血清組。

綜上可知，獨活寄生湯可能是通過調控PERK／Bip信號通路中關鍵調節因子PERK、Bip、eIF-2α、ATF-4、GADD153、Caspase-9 和 Caspase-3 蛋白表達，進而抑制軟骨細胞凋亡，從而起到治療KOA的作用。