數字共焦顯微鏡實驗3維點擴散函數的構建

鄧文波,陳 華,聶 雄

(廣西大學 計算機與電子信息學院,南寧 530004)

引 言

在數字共焦顯微技術的研究中，顯微鏡光學系統的3維點擴散函數(three-dimensional point spread function，3-D-PSF)的研究對3維顯微圖像復原有著重要的意義。3-D-PSF的準確估計對3維顯微圖像的復原效果有很大的關系[1-4]。在3維顯微圖像復原方法的研究以及實際工程應用中，采用的是理論點擴散函數或者實驗點擴散函數。理論點擴散函數可以通過光學系統傳輸函數模型進行構建[5-7]，也可以通過高斯型近似理論模型[3]構建。實驗點擴散函數是通過實驗獲取，主要是使用一個直徑盡可能小的熒光小球作為成像物體，在實驗室條件下通過獲取熒光小球的成像信息構建顯微成像系統的點擴散函數[8-11]。也可以以黑白跳變的圖像作為觀察物，利用CCD像平面上采集圖像進行擬合，獲得光學系統的點擴散函數[12]。

由于實驗獲取的3維點擴散函數針對特定顯微鏡光學系統，因此,采用以正確方法獲取圖像復原處理用的實驗點擴散函數，比采用理論點擴散函數進行圖像復原具有更為準確的復原效果。

本文中以熒光微珠模擬點光源，通過數字共焦顯微鏡采集一系列熒光微珠的圖像，構造顯微鏡光學系統的實驗3維點擴散函數，采用圖像平均法降低噪聲對點擴散函數的影響，獲取圖像復原處理用的實驗點擴散函數。

1 光學顯微鏡成像系統

1.1 3維點擴散函數理論模型

3-D-PSF在離散空域里可視為一個3維矩陣。是由沿著3-D-PSF雙錐體中心光軸(z軸)不同的徑向橫截面(x-y面)組成，每一個橫截面對應不同散焦量下的2維點擴散函數(two-dimensional point spread function，2-D-PSF)，其中z=0處中間截面為焦平面2-D-PSF。

圓形孔徑小散焦光學傳遞函數(optical transfer function,OTF)的數學公式為[13]：

(1)

式中，α=4πws/λ，βcos-1(q/fc),s=2q/fc,w=δzdNA2/2,J1(x) 為第1類1階貝塞爾函數，w為最大光程差，λ為發射光波長，q為頻率，fc為系統截止頻率，dNA為數值孔徑，δz為樣本空間的沿z軸的散焦距離，即散焦量。當散焦量δz取不同值時，得到不同的光程差w，進而通過(1)式得到不同散焦量的光學傳遞函數，通過傅里葉逆變換可以得到對應散焦量的一系列2-D-PSF，進而構成3-D-PSF。

1.2 顯微鏡成像原理

將厚度為T的3維樣本用平面模型表示為:

(2)

式中,N=T/Δz,Δz為物體平面沿z軸方向的微小間距。由3維顯微鏡成像系統可知，樣本在焦平面z′處所成像是每個平面與對應2-D-PSF卷積之和，即：

(3)

式中，g為顯微鏡成像，f為原始3維樣本，h為對應顯微鏡系統3-D-PSF，h(x,y,z′-iΔz),(i=1,2,…,N)表示散焦量δz為z′-iΔz的光學系統的脈沖響應函數，即2-D-PSF。當f為點光源且位于該焦平面時，即只有當x=0,y=0,iΔz=z′時，f才有不為0的值，其余情況下都為0，由以上公式可知，點光源通過顯微鏡系統后所得的顯微圖像即為顯微鏡焦平面2-D-PSF。通過改變點光源的位置，即改變(3)式中iΔz的大小，便可以得到一系列不同散焦量的2-D-PSF，進而可得出顯微系統的實驗3-D-PSF。

2 3-D-PSF實驗制作

2.1 實驗點光源制作

點光源實驗樣品的制備：本實驗中采用嵌于聚丙乙烯酰胺凝膠中的熒光微珠(F8803，Thermo Fisher公司)作為模擬點光源實驗樣品，熒光微珠直徑為0.1μm，激發光波長為460nm～485nm，發射光波長為510nm～525nm。將熒光微珠溶液稀釋1000倍，快速混勻后滴加至載玻片，待凝固后使用。

本實驗是利用尼康Nikon Ti-E顯微鏡在物鏡放大倍數M=40、數值孔徑dNA=0.55的條件下對熒光微珠進行序列圖像采集。

在使用實驗測量點擴散函數時，作為成像物體的熒光微珠其直徑應盡可能小。根據顯微鏡成像分辨率的判斷標準，兩個點光源剛好被分辨出來的條件是兩個點光源在物平面的距離滿足瑞利距離或者阿貝距離。瑞利距離計算公式為[14-15]：

δ=0.61λ/dNA

(4)

取發射波長λ=520nm，則δ=0.57μm，即只要兩個光源的距離大于0.57μm時，便可通過顯微鏡進行分辨。本實驗中采用的熒光微珠直徑為0.1μm，小于該瑞利距離，表明該熒光微珠可作為空間的一點。

2.2 圖像采集

2.2.1 光學切片圖像采集 實驗中使用尼康Nikon Ti-E顯微鏡，其搭載的高速電動控制系統，可以縮短圖像獲取的曝光時間，減少光毒對生物細胞的影響。該型號通過手柄或控制器可以控制電動XY載物臺和z軸，實現光軸最小步進為0.025μm的3維顯微圖像的采集。

在顯微鏡物鏡放大倍數M=40、數值孔徑dNA=0.55條件下，利用型號為Nikon DS-Qi1的非致冷單色CCD對熒光微珠圖像進行采集，其中光軸步進間隔Δ=0.2μm。圖1為在顯微鏡所采集的熒光微珠圖像。其中圖1b為圖1a中所框熒光微珠對應的局部放大圖(圖中灰度值是經過歸一化處理，以便顯示和觀察，并非反映實際強度值,下同)。可以發現，即使稀釋了1000倍，載玻片上的熒光微珠依然較多。在選取微珠研究對象過程中，一是注意要間距,由于散焦的影響，相鄰微珠相互干擾，在選取過程中盡量加大相鄰微珠的間距，以減少相互之間的干擾，提高采集圖像的真實性;二是要確保所選微珠均有較高能量(亮度),在顯微鏡系統中，系統噪聲不可忽視，隨著散焦的不斷增加，信號越來越弱，當信號大小低于噪聲大小時，主要信息將被噪聲所淹沒。

Fig.1 a—microscope picture of fluorescent microsphere b—partial enlargement

圖2為利用顯微鏡采集的一組不同散焦量的熒光微珠圖像，即不同散焦量的2-D-PSF (圖中數值為對應散焦量δz的值,下同)。通過一系列不同散焦量的2-D-PSF進而可以構造得到實驗3-D-PSF。由圖2可以明顯看出，隨著散焦量向兩側的增加，散焦像斑越來越大，圖像越來越模糊，同時兩側的散焦像斑存在差異。3維點擴散函數的3維空間坐標系z軸與顯微鏡光軸重合，原點為焦平面中心點。圖3為對應實驗3-D-PSF能量分布曲線(縱坐標表示圖像進行歸一化后像素大小，圖例數值為對應的散焦量δz)。其中圖3a為對應實驗3-D-PSF沿著z軸(x=y=0)的能量分布，圖3b為對應實驗3-D-PSF沿著徑向(x軸)方向的能量分布。從圖3中曲線可以看出：(1)在光軸方向上，3-D-PSF在z=0的焦面處能量最大，證實了3-D-PSF的能量主要集中在雙錐體中部的錐頂附近區域，離開焦面后能量迅速衰減；(2)在徑向方向上，3-D-PSF越遠離焦面其能量擴散范圍越大。

Fig.2 Experimental 3-D-PSF

Fig.3 Energy distribution of experimental 3-D-PSFa—along z axis b—along radial direction

2.2.2 多次采集平均 圖像采集采用的是非致冷CCD傳感器，在采集過程中產生的噪聲影響不可忽略。隨著散焦量的逐步增大，散焦像的亮度會迅速降低，散焦2-D-PSF的分布狀況受影響的程度迅速加大，進而影響所構建的3-D-PSF的準確性。為此，本實驗中采用多圖像平均法，對熒光微珠多次圖像采集以進行圖像平均運算，降低噪聲對所構建的3-D-PSF的影響。

本實驗中對熒光微珠進行4次圖像采集。圖像采集時，在同一實驗條件下，以熒光微珠中心區域設置為固定的截面定位點，每次圖像采集均以此截面定位點為基準，沿光軸從距離熒光微珠的上部12μm至下部12μm以0.2μm的步進距離進行微珠圖像采集，獲取微珠不同散焦量序列切片圖像。之后對4次采集的同一散焦量的4幅切片圖像進行圖像平均運算，平均后的圖像作為構建3-D-PSF的序列2D-PSF。

圖4即為4次采集實驗中3-D-PSF在每個平面中心點的能量分布情況(縱坐標表示圖像實際像素值，圖例T1～T4分別表示連續進行4次采集對應的實驗3-D-PSF)。圖4b為圖4a中曲線頂點部分局部放大圖，y軸為對應采集圖像像素大小。通過曲線可知，在微珠圖像采集過程中，隨著光照時間增加，熒光微珠受激產生的能量逐漸降低。為保證實驗結果的準確性，在挑選熒光微珠時，盡可能挑選能量較高、其處于焦面時的中心能量盡量與CCD最大量化值相接近，同時盡量縮短單次圖像采集曝光時間，以降低熒光微珠能量的衰減程度。

Fig.4 Energy distribution of PSF made by 4 experimentsa—energy distribution of center point b—partial enlargement

圖5是利用以上4次采集圖像通過多圖像平均法得出的不同散焦量的微珠序列切片圖像，即2-D-PSF。對比圖2單次采集的3-D-PSF切片圖像可以發現，利用多次采樣疊加平均法能夠在一定程度上降低顯微鏡系統噪聲對點擴散函數的影響。

Fig.5 Experimental 3-D-PSF after several images average

3 圖像復原

3.1 理論點擴散函數制作

(1)式的光學系統光學傳輸函數是理論點擴散函數的計算公式，結合顯微鏡系統相關參量、物鏡大小、CCD大小，以及顯微鏡成像特性及CCD圖像的數字化原理，可以通過該式計算獲得一組任意散焦量間隔的序列理論2-D-PSF。圖6所示為通過理論計算得到的一系列不同散焦量的2-D-PSF圖像。圖7為由該序列理論2-D-PSF構建的理論3-D-PSF能量分布圖(縱坐標表示圖像進行歸一化后像素大小，圖例數值為對應的散焦量δz)。其中圖7a為理論3-D-PSF能量沿軸向分布，圖7b為理論3-D-PSF能量沿徑向的分布。由圖7與圖3中曲線比較可看出，實驗3-D-PSF與理論3-D-PSF能量都是主要集中在3-D-PSF雙椎體結構的椎頂部分，能量分布沿軸向和徑向方向基本一致，而在局部區域有所不同。

Fig.6 Theoretical 3-D-PSF

Fig.7 Energy distribution of theoretical 3-D-PSFa—along z axis b—along radial direction

3.2 圖像復原分析

實驗中熒光微珠和生物熒光組織3維切片間距均為0.2μm；采用3-D-PSF空間大小均為101pixel×101pixel×101pixel，3-D-PSF在z軸間距亦為0.2μm；圖像復原方法采用迭代盲去卷積(iterative blind deconvolution，IBD)算法[16]，初始3-D-PSF分別為理論3-D-PSF和實驗3-D-PSF，迭代次數50次。

(5)

(6)

實驗1:對熒光微珠3維切片圖像的復原。在相同的條件下，分別利用實驗3-D-PSF和理論3-D-PSF對熒光微珠3維顯微鏡圖像進行去卷積圖像復原處理。圖8為對熒光微珠3維顯微圖像復原的效果。其中圖8a為采集的熒光微珠成像的原始3維重構光軸剖面(y-z面)圖，圖8b、圖8c分別為利用理論3-D-PSF和實驗3-D-PSF復原的微珠圖像3維重構光軸剖面圖。

Fig.8 Image restoration of microsphere

a—microsphere image b—theoretical 3-D-PSF restoration result c—experimental 3-D-PSF restoration result

由圖8可知，由于顯微鏡系統散焦的作用，熒光微珠通過顯微鏡成像后在3維空間上形成雙椎體結構，能量集中在椎體附近。采用兩種點擴散函數對熒光微珠3維圖像的復原均獲得良好的效果，在3維空間復原為一個微珠(亮點)。同時復原圖像的上下兩端均存在一些雜散信息，主要是由于在去卷積過程中，邊界部分無法確定造成的。但是對比發現，兩者的復原效果不完全相同，利用實驗3-D-PSF復原效果要比理論3-D-PSF復原效果要好。利用理論3-D-PSF復原的圖像雖然在空間上也形成了一個亮點，但是在旁邊還存在干擾，且亮度較小，而利用實驗3-D-PSF復原的圖像在空間中形成的亮點亮度較大，與原始亮度較為接近，且周圍干擾較小。

實驗2:對生物熒光組織3維切片顯微鏡圖像的復原。在相同的條件下，利用顯微鏡對熒光生物組織進行3維切片的采集，然后利用實驗3-D-PSF和理論3-D-PSF對熒光生物組織3維切片圖像進行去卷積圖像復原處理。

圖9中顯示了4組不同切片圖像的復原效果。圖9a為采集的熒光組織原始切片圖像，圖9b為對應利用理論3-D-PSF復原效果，圖9c為利用實驗3-D-PSF復原效果。圖10是熒光組織的圖像復原3維重構效果對比圖。其中圖10a為熒光組織原始3維重構顯示圖，圖10b、圖10c分別為利用理論3-D-PSF和實驗3-D-PSF復原的3維重構顯示圖。

Fig.9 Image restoration of fluorescent tissue

a—microscope images collected by microscope b—theoretical 3-D-PSF image restoration c—experimental 3-D-PSF image restoration

Fig.10 Image restoration of 3-D fluorescent tissue

a—original fluorescent tissue b—theoretical 3-D-PSF restoration result c—experimental 3-D-PSF restoration result

由圖9和圖10可知，在原始樣本中，由于相鄰層散焦層對焦平面層之間的相互干擾，采集的切片圖像即包含該焦平面圖像信息，又含有相鄰散焦面的信息，使得采集圖像模糊，3維重構圖像中無法看清內部結構。而通過實驗3-D-PSF和理論3-D-PSF對圖像進行復原時，能較好去除相鄰散焦面對圖像的影響，處理后圖像在每層中保留了該焦平面的主要信息，均獲得良好的復原效果，并很好地實現了生物組織的3維重構。另外，實驗3-D-PSF和理論3-D-PSF兩者的復原效果不完全相同，仔細觀察，實驗3-D-PSF的復原效果更好。

4 結 論

利用熒光微珠實際測量系統的3-D-PSF，可以彌補理論3-D-PSF無法表征實際光學系統在生產制造過程中存在不可避免的偏差問題和噪聲因素的缺陷，使得實驗3-D-PSF更符合該光學系統的光學傳遞特性。本文中以熒光微珠模擬點光源，通過數字共焦顯微鏡對熒光微珠的不同截面和不同散焦量的切片圖像進行采集，通過4次采集得到相同的序列熒光微珠圖像，采用多圖像疊加平均法進行處理，降低噪聲的影響，構建顯微鏡光學系統的實驗3-D-PSF。以該實驗3-D-PSF與理論3-D-PSF對熒光微珠切片圖像以及熒光生物組織3維切片圖像進行去卷積復原處理和對比分析。實驗結果表明，實驗3-D-PSF與理論3-D-PSF均獲得良好的復原效果，而實驗3-D-PSF具有更好的復原精度。