武漢野田村病毒異源蛋白插入位點的篩選

司杰

摘要：為了評估武漢野田村病毒衣殼蛋白是否能形成一種新的異源多肽和蛋白的展示系統，本論文實驗根據生物信息學手段，應用穿線法（Threading）分析WhNV衣殼蛋白的結構，選取氨基酸位置1/1L（131 aa -132 aa）、2（148 aa -149 aa） 、3（180 aa -181 aa） 、4（191 aa -192 aa）、 5/5L（209 aa -210 aa），L為在同一位點兩邊加Linker（甘氨酸短肽），插入報告蛋白EGFP的基因序列，以T-IE2質粒為載體構建可以瞬轉sf9的T-IE2-1，T-IE2-1L，T-IE2-2，T-IE2-3，T-IE2-4，T-IE2-5，T-IE2-5L的克隆。運用熒光顯微鏡觀察及western-blot檢測轉染細胞，篩選出能高效表達融合蛋白的位點克隆T-IE2-1，T-IE2-1L，T-IE2-2，T-IE2-5L。

關鍵詞：武漢野田村病毒；衣殼蛋白；EGFP蛋白；展示系統；位點篩選

1、前言

20世紀40年代以來，昆蟲病毒作為生物殺蟲劑的應用前景，被漸漸發掘，特別是桿狀病毒已成為生物殺蟲劑的主要來源。昆蟲病毒的復制，裝配和宿主的相互影響終將會對生命科學研究產生重要影響，該領域已成為微生物研究領域中的熱門之一[1]。

菜青蟲是菜粉蝶Artogeia（Pieris） rapae （Linnaeus） 又名菜白蝶、白粉蝶的幼蟲，菜粉蝶屬粉蝶科中的鱗翅目。菜青蟲主以幼蟲啃食作物葉片的方式危害甘藍、蘿卜、花椰菜等十字花科蔬菜，導致收成量減少。武漢野田村病毒是在我國境內發現的第一個能以昆蟲為感染宿主的野田村病毒，也是第一次從菜青蟲體內分離得到的野田村病毒科成員。目前，對于菜青蟲病毒的研究可以對蟲害的防治提供理論依據[2]。

武漢野田村病毒是單鏈正義RNA病毒，其基因組全長約為4.6 kb，包括RNA1（3.1 kb）和RNA2（1.5 kb）。RNA1編碼RNA依賴的RNA聚合酶 protein A，protein A不但復制基因組RNA，同時在病毒增殖過程中復制亞基因RNA3；RNA2編碼衣殼蛋白前體Pro α，在裝配過程中180個拷貝的Pro α組裝成T=3的正二十面體對稱結構，經過自我切割后成為成熟的具有感染性的病毒粒子。野田村病毒衣殼蛋白中有一個β桶狀結構，這個結構在已經研究的野田村病毒科的成員中都呈保守趨勢。桶狀結構的反向平行鏈通過幾個形狀大小都不同的裸露在病毒粒子表面的莖環相連。表面的莖環結構構象差別很大，由此推測野田村病毒的衣殼在表面莖環的構象改變的情況下仍能折疊和組裝正確形成病毒粒子，因而，較大的異源多肽或完整的蛋白可以插入到這些莖環結構中，卻對衣殼蛋白影響不大。這些特性使得野田村病毒的衣殼蛋白可以作為一種新的異源多肽和蛋白的展示系統[4]。野田村病毒科中的Flock House virus（FHV）[5]衣殼蛋白結構的研究顯示該蛋白表面有5個莖環，在這些莖環中插入異源多肽時不會引起較大的結構變化。目前，已經成功融合到VLPs的異源多肽包括人類免疫缺陷性病毒（HIV）的包膜蛋白gp41、乙型肝炎病毒表面抗原HbsAg，人炭疽熱毒性受體2（ANTXR2[6]。同作為野田村病毒科成員的武漢野田村病毒衣殼蛋白的相關研究卻處于空白階段。

2、武漢野田村病毒衣殼蛋白插入異源蛋白位點的預測及克隆的構建

2.1實驗材料與方法

2.1.1實驗材料

2.1.1.1生物信息學軟件（robetta在線模建服務器，Swiss-PdbViewer VERSION 4.0.1

2.1.1.2質粒、菌種

pIZT/V5-his載體，pMD18-T-simple （TaKaRa公司），T-IE2載體質粒，載體由pIZT/V5-his改造，即PCR擴增啟動子OpIE2啟動子序列后，連接pMD18-T-simple載體構成，全長3567bp，Amp抗性，pWh2（G，0）質粒即RNA2的cDNA克隆，載體為pMD18-T（TaKaRa公司），大腸桿菌TOP10

2.1.2方法

2.1.2.1WhNV衣殼蛋白的三維結構的預測

運用穿線法測定武漢野田村病毒衣殼蛋白的三維結構；

a）在數據庫中取一條已知模板與武漢野田村病毒衣殼蛋白序列作序列比對。

b）將模板蛋白質序列匹配上的殘基的空間坐標賦給武漢野田村病毒衣殼蛋白上的相應殘基。

c）將這個操作應用于所有的取用模板中，取能量值最低的模板產生的武漢野田村病毒衣殼蛋白序列的空間坐標，即為武漢野田村病毒衣殼蛋白的三維結構。

2.1.2.2引物設計及插入EGFP的完整序列的克隆

用Primer5.0根據衣殼蛋白的ORF及EGFP設計引物。包括兩端分別包含EcoRⅠ和NotⅠ的酶切位點引物；EGFP插入預測位點1/1L（131 aa -132 aa）、2（148 aa -149 aa） 、3（180 aa -181 aa） 、4（191 aa -192 aa）、 5/5L（209 aa -210 aa），L為在同一位點兩邊加Linker（甘氨酸短肽），示意圖如下（2.1）

圖2.1.：131aa-132aa，14aa-149aa，180aa-181aa，191aa-192aa，209aa-210aa間插入EGFP ；131 aa -132 aa，209 aa -210 aa間插入加linker的EGFP

以衣殼蛋白序列和EGFP序列為模板，使用以上引物，進行PCR擴增， 將回收產物與T-IE2載體分別用限制性內切酶EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切5小時。回收酶切產物以T4連接酶16℃連接過夜，轉化大腸桿菌感受態細胞，涂amp抗性平板，挑取平板上的單菌落，接種于4ml氨芐抗性培養基中，37℃，220rpm，搖床培養過夜，提取質粒，電泳測序鑒定。

2.2實驗結果

2.2.1武漢野田村病毒衣殼蛋白結構分析

利用數據庫提供的模板，運用穿線法模建衣殼蛋白的三維結構圖，運用Swiss-PdbViewer展示單體如圖2.2。單體是由α螺旋，β折疊片及連接不同折疊間的莖環組成。β折疊片編織成致密的β桶，結構較穩定，不能選擇成為插入位點，而松散在表面的莖環插入異源多肽時不會引起較大的結構變化[7]。

2.2.2插入EGFP的完整序列的克隆鑒定

武漢野田村病毒衣殼蛋白ORF長1293bp，EGFP的ORF長717bp，添加linker18氨基酸長54bp，即完整序列1，3，4， 5為2010bp，1L，5L為2064bp。T-IE2載體長3567bp。節選圖2.3-2.5中泳道3中出現，3條帶是雙酶切不完全造成，最上面一條為單酶切產物，中間一條為切下的線型T-IE2空載，最下面一條為完整序列。陸續送樣測序，最終所有選定的預測位點1/1L（131aa -132 aa）、2（148 aa -149 aa） 、3（180 aa -181 aa） 、4（191 aa -192 aa）、 5/5L（209 aa -210 aa）的克隆T-IE2-1，T-IE2-1L，T-IE2-2，T-IE2-3，T-IE2-4，T-IE2-5，T-IE2-5L構建正確。

3、武漢野田村病毒衣殼蛋白插入異源蛋白可行性位點的初步篩選

3.1實驗材料與方法

3.1.1實驗材料

3.1.1.1化學試劑

抗生素氨芐和鏈霉素（invitrogen），標準胎牛血清（杭州四季青公司）顯色底物NBT/BCIP（碧云天公司），六孔細胞板，FuGENE HD 轉染試劑盒（Roche），熒光倒置顯微鏡Nikon Eclipse TE 2000-U Fluorescencemicroscope（Nikon， Tokyo， Japan），Bio-Rad公司蛋白質電泳及轉膜系統，抗EGFP標簽鼠單克隆抗體（康為世紀），羊抗鼠AP標記的抗體（北京康為公司），衣殼蛋白兔源抗體（免疫新西蘭白兔制得）

3.1.1.2質粒，細胞

草地貪夜蛾Sf9細胞：中國典型培養物保藏中心提供；第二章所構建好的質粒標簽為1，1L，2，3，4，5，5L。

3.1.2方法

細胞培養基的配制；質粒的轉染及熒光顯微鏡觀察；Western blot方法檢測衣殼蛋白插入EGFP的重組蛋白（具體做法參照文獻8進行.）

3.2實驗結果

3.2.1轉染細胞的熒光觀察

將第二章中構建成功的T-IE2-1，T-IE2-1L，T-IE2-2，T-IE2-3，T-IE2-4，T-IE2-5，T-IE2-5L及對照組T-IE2-EGFP質粒提純轉染進狀態穩定，長勢良好的sf9細胞，48小時后，熒光顯微鏡下觀察（如圖3.1）

3.2.2融合EGFP的衣殼蛋白的western-blot檢測

M，蛋白marker（130kDa，fermentas）；1，未轉染質粒的空細胞；2，轉染T-IE2-1；3，轉染T-IE2-1L；4，轉染T-IE2-2；5，轉染T-IE2-3；6，轉染T-IE2-4；7，轉染T-IE2-5；8，轉染T-IE2-5L

將3.2.1中的觀察過的轉染T-IE2-1，T-IE2-1L，T-IE2-2，T-IE2-3，T-IE2-4，T-IE2-5，T-IE2-5L的細胞收集，制樣，10%SDS-PAGE電泳，轉膜，一抗1：2000抗EGFP標簽鼠單克隆抗體，二抗1：1000羊抗鼠AP標記的抗體，顯色如圖3.2。

3.3討論

熒光圖片中，實驗組的熒光亮度即使是最亮的1和1L仍然沒有陽性對照組的亮度強，說明融合蛋白的包裝折疊是一個復雜的過程，只有折疊正確的EGFP才會有熒光產生，兩種蛋白相互作用相互影響各自的構象，顯然包裝效率遠遠低于野生型EGFP。由圖中看出Loop1和Loop2都產生較強的熒光，Loop3和Loop4幾乎沒有熒光，說明這兩個位點不適合引入異源蛋白，插入的序列很可能被衣殼蛋白包裝進內部。Loop5產生了微弱熒光，在添加linker后的5L位點，熒光亮度大大增強 ，同種情況也體現在1L上。說明linker可以有效的增強插入外源蛋白或者多肽的空間柔韌性，能夠促使重組衣殼蛋白的正確包裝。

由于衣殼蛋白的ORF約2kb，EGFP的ORF約717bp，由此測算融合蛋白的大小約75KD。Western-blot結果同熒光觀察的結果較一致1/1L，2，5/5L，都能觀測到約75KD的條帶，其中1和1L的融合蛋白表達量幾乎一致，2次之，5L幾乎與2一致，Loop5量較少，Loop3和Loop4觀測不到熒光但western同樣出現了條帶，分析可能是表達了融合蛋白，卻是折疊包裝后構象不正確，不能使EGFP發光，但western檢測的是變性的蛋白，所以同樣可以看到正確大小的蛋白。本實驗中篩選出的表達效率較高的1/1L（131aa-132aa）已經可以為后續的實驗電鏡觀察病毒類似粒子構筑了良好的實驗平臺。

參考文獻：

[1]胡遠揚.昆蟲病毒研究的回顧與展望[J]。中國病毒學，2004，19（3），302-309

[2]蔡大威.菜青蟲野田村病毒基因組結構及B2蛋白功能研究[D].武漢：武漢大學，2009

[3]Scherer， W.F.， Hurlbut， H.S.， 1967. Nodamura virus from Japan： a new and unusual arbovirus resistant to diethyl ether and chloroform. Am. J. Epidemiol.， 86， 271-285.

[4]Grabherr， R.， Ernst， W.， Oker-Blomand， C.， Jones， I.， 2001. Development in the use of baculoviruses for the surface display of complex eukaryotic protein. Trends in biotech. 19， 231-236.