滿藥復方木雞顆粒抗菌和抗癌活性研究

金黎明，李春斌，權春善，侯熙彥，趙 晶，胡文忠

(1.生物技術與資源利用教育部重點實驗室，遼寧 大連 116605；2.大連民族大學 生命科學學院，遼寧 大連 116605)

滿藥復方木雞顆粒來源于滿族醫藥中治療肝病的傳統偏方“木雞湯”，由木雞(即云芝)和核桃楸皮兩味藥物組成，在原有藥物基礎上加入了具有扶正袪邪功效的山豆根、菟絲子，形成了現在的復方制劑，其中核桃楸皮為首次入藥的民族藥物[1-2]。經過30多年的臨床應用證明，該復方對慢性乙型病毒性肝炎、肝纖維化、肝硬化、肝腹水等各種肝病具有很好的治療效果，是目前國內唯一的肝癌前期阻斷治療藥物，具有顯著的預防和治療肝癌作用[3-6]。

近年來，研究者對復方木雞顆粒對除肝癌細胞外的其他多種癌癥細胞的作用進行了研究，結果表明，其對人宮頸癌細胞株(Hela)、人肺腺癌細胞株(A549)、人急性早幼粒白血病細胞株(HL-60)、紅白血病細胞株(K562)和人Burkitt淋巴瘤細胞株(Raji)等都有一定抑制生長、誘導凋亡的作用[7]；對不同p53野生基因型的人結腸癌細胞(SW620p53mt、SW480p53mt、 HCT116p53wt)有明顯的抑制生長作用[8]；對艾氏腹水癌細胞有直接殺傷作用[9]。此外，對肝癌外的其他晚期惡性腫瘤都有一定的療效[10]。提示了復方木雞顆粒除防治肝病外，可能具有其他藥理作用。

本實驗研究了復方木雞顆粒對金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、副溶血弧菌、白色念珠菌5種致病菌的抑菌活性，以及對結腸癌細胞HT-29的抑制作用，為滿藥復方木雞顆粒功能的研究進一步補充了數據。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

1.1.1 藥物

復方木雞顆粒，遼寧丹東藥業有限公司提供。

1.1.2 菌株、細胞與試劑

指示菌：金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、副溶血弧菌和白色念珠菌為實驗室保藏菌。

結腸癌細胞HT-29，購自中國科學院細胞庫。

LB培養基：胰蛋白胨10 g·L-1，酵母提取物5 g，氯化鈉5 g，瓊脂20 g，去離子水1 000 mL，pH約為7.0。

試劑：DMEM培養基、胰蛋白酶、胎牛血清、四甲基偶氮唑鹽(MTT)，購于GIBCO公司。

1.1.3 儀器

SW-CJ-2FD潔凈工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司)；MT-180B生化恒溫培養箱(上海新苗醫療器械制造有限公司)；ZWY-A2102C雙層可編程恒溫搖床(上海智誠分析儀器制造有限公司)；HERAcell150I二氧化碳培養箱(美國BTX)；LOGIC4 A2生物安全柜(美國LABCONCO)；SYNERGYH1多功能酶標儀(美國BIOTEK)。

1.2 實驗方法

1.2.1 抗菌活性測定

采用瓊脂平板打孔法測試復方木雞顆粒的抗菌活性[11]。

用去離子水溶解復方木雞顆粒，在80 ℃水浴鍋中加熱30 min(滅菌并使藥品完全溶解)，將制備好的藥劑樣品在超凈工作臺中用連續10倍稀釋的方法，配制0.200、0.020、0.002 mg·mL-1三個不同質量濃度，待用。

LB培養基融化后，室溫放置至40 ℃左右，接入供試菌種，倒平板，待培養基凝固后，用打孔器在平板內的培養基上打4個孔，分別注入3個質量濃度(0.200、0.020、0.002 mg·mL-1)的復方木雞顆粒溶液各200 μL，對照孔加入200 μL去離子水。

將培養皿放入培養箱內，37 ℃條件下培養12 h，觀察抑菌圈的大小并測量抑菌圈的直徑，做好記錄。每個樣品重復3次，對所得結果進行分析。

1.2.2 體外抗腫瘤活性檢測

應用MTT法檢測復方木雞顆粒對結腸癌細胞HT-29生長的抑制作用。將復方木雞顆粒用超純水溶解，配制成0.2 mg·mL-1，微孔濾膜過濾除菌待用。取對數生長期的結腸癌細胞HT-29，以2×104個·mL-1密度接種于96孔培養板中，加入樣品溶液100 μL，37 ℃，5% CO2條件下分別繼續培養12、24、48、72 h，空白對照組加入DMSO(使DMSO終濃度為0.03%)，每組重復3個復孔。于培養結束前4 h，每孔加5 mg·mL-1MTT溶液10 μL，繼續培養。終止培養后，1 000 r·min-1離心10 min，吸取并棄掉培養液，在每孔中加入100 μL DMSO，震動10 min，使結晶物充分溶解，用自動酶標儀測定570 nm波長下各孔的吸光度(A)，將A值作為反映結腸癌細胞HT-29的細胞活性及代謝狀況的參數[12]。

生長抑制率計算公式為

(1)

2 結果與討論

2.1 抗菌活性測定結果

用瓊脂平板打孔法研究復方木雞顆粒對金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、副溶血弧菌、白色念珠菌5種致病菌的抑菌活性，測定結果見表1。效果圖如圖1，其中1：對照，去離子水；2：0.002 mg·mL-1樣品；3：0.020 mg·mL-1樣品；4：0.200 mg·mL-1樣品。

表1 抑菌活性測定結果

(a)副溶血弧菌 (b)金黃色葡萄球菌 (c)白色念珠菌

復方木雞顆粒對金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌、白色念珠菌具有抑制活性，質量濃度為0.200 mg·mL-1的樣品對三種菌的抑菌圈分別為(26.29±0.35)mm、(24.52±0.44)mm、(25.13±0.26)mm；而在這三種濃度下，對大腸埃希氏菌、鼠傷寒沙門氏菌都沒有顯示出抑制活性。

2.2 抗腫瘤活性測定結果

復方木雞顆粒對結腸癌細胞HT-29的生長抑制率如圖2。復方木雞顆粒對結腸癌細胞HT-29具有較明顯的抑制作用，隨著培養時間的增加，生長抑制率越來越高，培養72 h后，生長抑制率達到85.52%。

圖2 對結腸癌細胞HT-29的生長抑制率

復方木雞顆粒對結腸癌細胞HT-29培養72 h的生長抑制活性圖3。

(a)對照組 (b)實驗組

3 結 論

本實驗用瓊脂平板打孔法研究了滿藥復方木雞顆粒對金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、副溶血弧菌、白色念珠菌5種致病菌的抑菌性能。結果表明，復方木雞顆粒對金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌、白色念珠菌具有抑制活性，0.2 mg·mL-1的樣品對三種菌的抑菌圈分別為(26.29±0.35)mm、(24.52±0.44)mm、(25.13±0.26)mm。此外，復方木雞顆粒對結腸癌細胞HT-29有較明顯的抑制作用，培養72 h后，生長抑制率達到85.52%。

近年來，國內對民族藥的研究有升溫趨勢，但目前多集中在藏藥、蒙藥、苗藥等民族藥，對滿藥的研究尚不多見，亦沒有形成規模體系。復方木雞顆粒作為最著名的傳統滿藥之一，仍具有很大的研究價值和開發空間[1]。關于復方木雞顆粒的前期研究多集中在肝病治療方面，而本實驗研究了復方木雞顆粒的抑菌作用以及對結腸癌細胞HT-29的抑制作用，為復方木雞顆粒功能的進一步研究提供了數據。