十字花科根腫病菌在水中存活能力檢測分析

袁 遠 ，曹 喆 ，杜 飛，何鵬飛，何月秋 ，吳毅歆

（1.云南農業大學植物保護學院，云南 昆明 650201;2.云南農業大學農學與生物技術學院，云南 昆明 650201）

由蕓薹根腫病菌（Plasmoliophora brassicae Woronin）侵染所致的十字花科蔬菜根腫病是十字花科蔬菜的世界性病害之一。該病害導致十字花科蔬菜產量下降，甚至絕收，是一種常見且危害嚴重的真菌病害［1-5］。該病在我國境內十字花科作物上均有發生，發病面積約67萬hm2，造成嚴重的經濟損失，已經嚴重影響我國十字花科作物生產。該病的病原菌是一種土傳性活體寄生菌，專性寄生于十字花科植物，不能進行人工培養，病菌從休眠孢子囊萌發產生游動孢子侵入根部，經10 d左右致根系形成腫瘤，游動孢子是該病傳播的主要危害［7］。根腫病的發生受溫度、濕度、土壤pH、光照、土壤含水量和病原菌數量的影響，帶菌水傳播也是根腫病迅速傳播的主要原因之一［8］。對根腫菌生活史的研究國外比國內早，基本上大部分實驗室都是在明確生活史的前提下通過雙重培養技術和懸浮細胞培養技術來研究十字花科植物根腫病的發病全過程。在我國這方面的報告還很少，處于啟蒙階段［9］。國內外對根腫病的研究一直都很重視，通過不懈的努力在致病機理、病原菌生理小種鑒定、根腫菌防治、病原體離體技術等方面均取得了突破性進展［9-18］。目前對于休眠孢子的萌發環境及侵染能力之間互作關系的研究還不是太多。為了更好地防治根腫病的發生，對影響根腫病休眠孢子萌發的生物及非生物因子的研究十分必要［19-20］。本研究通過對不同溫度水體根腫菌存活情況和水中微生物活動及各項水體指標的檢測結果，為研究根腫病休眠孢子萌發的生物及非生物因子和環境及侵染能力之間的互作關系提供依據，為根腫病的田間防治提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試根腫病菌于2017年1月采自昆明市周邊白菜種植大棚的病變白菜根腫組織。

1.2 根腫菌孢子檢測方法

水體根腫菌孢子檢測方法采用趙瑋琦等［10］方法稍作修改檢測，并建立熒光定量PCR標準曲線。

1.3 根腫菌的定量檢測

使用0.22 μm濾膜抽濾樣本水體富集水體微生物，抽濾20～150 mL水體樣本，直至濾膜堵塞難以抽濾，記錄所抽濾水體體積。將濾膜剪碎分裝入2 mL離心管中，依據DNA Water Kit（OMEGA公司）的說明書提取DNA，用于熒光定量PCR檢測。結果對照標準曲線計算DNA濃度，帶入所抽濾水體體積，計算原水體根腫菌孢子濃度。

1.4 孢子懸浮液制備

取100 g白菜根腫組織與200 mL純凈水打碎成勻漿狀，四層紗布過濾分裝入50 mL離心管中，2 500 g/min 離心20 min，棄上清液，沉淀重懸于50 mL純凈水中，該步驟重復3～4次；加入5 mL 50%蔗糖溶液懸浮，2 500 g/min離心20 min；將上清液移入一新的離心管中加入45 mL純凈水，2 500 g/min離心20min，棄上清；沉淀溶于5 mL純凈水中，保存于4℃冰箱中。

1.5 不同水體溫度根腫菌存活檢測

試驗設4個溫度梯度16、19、22、25℃，將4個光照培養箱調節至上述4個溫度，每個溫度下放置3個模擬水體樣品作為3個重復，另設一個2 L不含孢子的無菌蒸餾水樣品作為空白對照。

使用血球計數板于顯微鏡下計算孢子懸浮液中孢子濃度。制備12個模擬水體樣品，每個樣品在一個塑料桶中加入1 990 mL純凈水，加入10 mL稀釋后的孢子懸浮液，將樣品的孢子濃度調節至1×106CFU/mL。使用0.1 mol/L HCl溶液將樣品pH值調節至5.5；使用電導率儀檢測測水體電導率，0.1 mol/L NaCl溶液將樣品鹽度調到統一值。定期提取各個樣品的DNA用于熒光定量PCR檢測計算樣品水體，同時測量各處理的化學需氧量（COD）和溶解氧含量（DO）。

2 結果與分析

2.1 不同水體溫度下的根腫菌孢子濃度

將模板 DNA 稀釋為 1×107、1×106、1x105、1×104、1×103、1×102、1×101拷貝 /μL 7 個不同梯度用于進行熒光定量PCR。以模板DNA起始濃度的對數值（x）為橫坐標，以Ct值（y）為縱坐標作熒光定量PCR標準曲線，如圖1所示。標準曲線為y=-3.101x+34.594，擴增效率97%，R2=0.9995。從圖2擴增曲線上可發現該對引物的精確度為10拷貝/μL，陰性對照信號出現在30～35個Ct值范圍內，超過30個Ct的信號默認為是陰性信號，該信號由引物二聚體所產生。根據所得的熔解曲線（圖 3）可知，在熔解溫度 Tm=84.5℃出現單一峰形，未見其他峰值，說明擴增效率和熔解溫度均一，擴增產物特異性好，以此為基礎進行定量是可靠。

圖1 根腫菌質粒DNA梯度稀釋后繪制的標準曲線

圖2 不同濃度梯度質粒標準品擴增曲線

圖3 不同濃度梯度質粒溶解曲線

2.2 不同水體溫度對根腫菌存活的影響

在4個水體溫度梯度16、19、22、25℃，分別接種濃度為3×106CFU/mL根腫菌孢子。水溫在16～25℃區間內，隨著溫度的提高，根腫菌孢子下降的速率變緩，在25℃時最為緩慢，處理30 d達1.88×106CFU/mL，并在處理60 d后相對穩定，說明根腫菌在25℃下較其他溫度更容易存活（表1）。

表1 不同時期各處理孢子濃度

電導率與溶液中離子的含量成比例關系，可間接判斷水中溶解物質的含量。從表2可見，隨時間的延長，各處理電導率都呈緩慢增大。說明處理中根腫菌呈增長趨勢。

表2 不同處理水體電導率變化情況（103μS/cm）

溶氧量是衡量生物在水中生存的重要指標。氧在水中的含量因有機物分解及生物呼吸把氧消耗掉而使水中溶氧量經常會改變。從表3可見，不同時期各溫度處理的溶氧量隨處理時間增長出現不規律的浮動，說明微生物活動頻繁。

表3 不同處理水體溶氧量變化情況（mg/L）

COD作為衡量水中有機物質含量的指標，化學需氧量越大，說明水體中有機物的數量多。從表4可見，不同時期各處理的COD隨時間增長呈現普遍上升的趨勢，且不具有規律性。COD值越高說明水中根腫菌的數量越多。

表4 不同處理水體化學需氧量變化情況（mg/L）

3 結論與討論

根腫病的發生受溫度、濕度、土壤的pH值、光照、土壤含水量和土壤中病原菌數量的影響。根腫病發生的最主要條件是土壤中大量存在的根腫菌休眠孢子［21］。根腫菌休眠孢子可以通過很多途徑進行傳播。帶菌水傳播也是根腫病迅速傳播的主要原因之一［8］。在根腫病發生區，不僅地塊之間灌溉水漫灌和串灌現象普遍，而且種植戶常在公共水源中清洗蔬菜，隨意丟棄病株或將帶病的蔬菜賣給養魚戶喂魚，再用這些被污染了的池塘、水庫中的水灌溉農田，從而加速了病菌擴散與蔓延，使病害發生面積逐年擴大。根腫病菌傳播，且孢子量越多，感病率越高。研究作物根腫病的傳播途徑，對規模化育苗和灌溉水處理控制病害有重要意義。灌溉水攜帶病原傳播植物病害是影響農作物產量的重要原因，水池育苗能加快病害的蔓延速度，尤其在可利用水較少、降雨量偏少、水分有限時，這種狀況更為嚴重。灌溉水中含有根腫菌曾有報道［8，12］，但已有的研究并未能詳細闡述灌溉水中所含根腫菌的數量與其致病性和病害傳播流行之間的關系［17-18］。

本研究利用實驗團隊首創的水體中根腫菌孢子熒光定量 PCR 檢測體系［10］，建立QPCR標準曲線來檢測根腫菌的孢子數量，對不同溫度水體根腫菌存活的情況進行檢測，實驗結果表明在16～25℃區間內，隨著溫度的提高，根腫菌孢子下降的速率變緩，在25℃時相對最為緩慢，這與過去的研究中認為根腫菌最適宜的發病溫度在20～25℃區間內的結論相一致。試驗中孢子濃度隨著時間的推移可以下降到原濃度的1 000倍以下，但是通過對判斷水體中生物活動的主要指標電導率、溶氧量及化學需氧量指標的檢測可以發現在此期間水中的微生物數量呈上升趨勢且活動十分的劇烈，這與孢子濃度隨水溫升高而增加的結果測定結果相吻合，說明隨溫度的增高孢子濃度不斷增加，隨著時間推移水體中孢子濃度降低但根腫病數量呈上升趨勢且活動十分的劇烈。但是與田間環境可能存在較大的差異，這是否會對試驗的結果造成影響還有待進一步的研究。除此之外，光照、pH、有機質含量等因素也會對根腫菌孢子的存活造成一定的影響，還需要更進一步的研究闡明這些因素與水體中根腫菌存活能力存在著怎樣的聯系。