蒙藥嘎日迪-13味丸最佳提取工藝的優選

烏仁圖雅 楊烏日娜 趙薩茹拉 賀喜格達來

(鄂爾多斯市蒙醫醫院，內蒙古 鄂爾多斯 017010)

嘎日迪-13味丸(扎沖-13味丸)是蒙醫常用藥,由訶子、草烏、石菖蒲、木香、麝香、珊瑚、珍珠、丁香、肉豆蔻、沉香、禹糧土、磁石、甘草等13味單藥組成[1],出自《至高要方》古籍。現收載于《衛生部藥品標準(蒙藥分冊)》[2]，在《中國醫學百科全書》《蒙藥方劑學》(統編教材)[3]均有記載。主要功能是祛風通竅，舒筋活血，鎮靜安神，除“協日烏素”;主治半身不遂，左癱右瘓，口眼歪邪，四肢麻木，腰腿不利，言語不清，筋骨疼痛，神經麻痹，風濕，關節疼痛。實驗研究表明，具有抗血栓、抗真菌抗炎[4]、清除自由基[5]、腦缺血損傷保護作用[6-8]。臨床研究表明，嘎日迪 -13 治療糖尿病周圍神經病變[9]、腦埂塞[10]、腰椎間盤突出癥[11]等療效確切，未見嘎日迪 -13 抗真菌感染相關的報道。

白色念珠菌又名白色假絲酵母菌,是一種人類和動物共患的深部條件致病性酵母菌,該菌可引起人的黏膜、皮膚、消化道、呼吸及神經系統等感染,引起白色念珠菌病(簡稱念珠菌病)。隨著免疫抑制劑、抗生素及侵入性治療方法的廣泛應用,免疫低下患者數量逐年增加,真菌感染日漸增多,危及生命的深部真菌感染已成為醫院監測和研究的重點[12]。白色念珠菌是目前深部真菌感染中最常見、最主要的病原體之一,深部白色念珠菌感染的病死率高達68.90%[13]。

本試驗在綜合文獻資料的基礎上，考慮乙醇提取濃度、料液比、提取次數、提取時間等多種影響因素，采用正交設計試驗以浸膏得率及抑制白色念珠菌生長的最低藥物濃度(MIC90)值為指標，對嘎日迪-13味丸提取工藝條件進行優選。

1 材料與方法

1.1 蒙成藥 嘎日迪-13丸(內蒙古鄂爾多斯市蒙醫研究所制，批號20170524)。

1.2 菌株及培養基 白色念珠球菌 (candida albicans)(菌種編號98001)由中國食品藥品檢定研究院購買。RPMI1640 sigma R8755-10×1L、馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)。

1.3 主要儀器和試劑 96孔細胞培養板(NUNC163320)、血細胞計數板、生物安全柜(BSC1500ⅡA2-X型山東博訊)、BSP250型生化培養箱(山東博訊)、旋轉蒸發儀、干燥箱、中藥粉碎機、二甲亞砜(DMSO)、無水乙醇、蒸餾水。

1.4 有效成分提取工藝的正交試驗設計 以料液比(A)、提取次數(B)、提取時間/次(C)及溶媒濃度(D)為考察對象，并根據單因素實驗依據，擬定各因素的3水平(表1)，以提取物有效成分的得率、浸膏MIC值為綜合考察指標，選用 L9(34)正交試驗表進行實驗，從而篩選出最佳的提取工藝條件。

按規定量稱取藥物9份，每份約10g ，分別粉碎并編號1～9 ；精確稱量9份藥物粉末，于溶媒中加熱回流提取，合并濾液并濃縮濾液至糊狀，放入105℃烘箱中3h ，直至烘干到恒重浸膏狀態，測質量并計算得率，封存備用，分別重復3次。見表1。

表1 嘎日迪-13提取工藝主要因素

1.5 正交試驗蒙藥有效成分的體外抑菌活性試驗

1.5.1 菌懸液的制備 制備RPMI1640液體培養基和 PDA培養基，并于4℃冰箱保存備用。取試驗所用白色念珠菌菌種接種至PDA平板，28℃培養1周，活化2次，使菌落均勻覆蓋PDA平板。用接種針挑取菌落于適量生理鹽水，并用吸管吹打菌落，使菌游離于生理鹽水中。經血細胞計數板計數。

1.5.2 藥液的制備 精確稱取各正交試驗的提取物浸膏溶于10% DMSO中，配制成浸膏質量濃度為64mg/mL的溶液備用。臨用前將藥液用RPMI1640培養液按倍比稀釋法稀釋至工作濃度，提取物的工作濃度為32，16，8，4，2，1，0.5，0.25，0.125，0.06.0.03 mg/mL。

1.5.3 藥敏試驗方法 無菌96孔平底板(U型)微量板用紫外燈照射30min后，在每一排1～10孔內分別加入藥物工作濃度100μL ，然后再加入上述制備的真菌菌液100μL，第11孔為陰性對照(只含RPMI1640培養液100 μL 和藥物100 μL ，不含菌液)，12孔為陽性對照(只含培養液100 μL和菌液100 μL ，不含藥物)。置于微量振蕩板上振蕩5min ，使各種液體充分混勻，35℃培養48h ，MIC90(最低抑菌濃度)值的判讀：將藥敏板每孔生長情況與陽性及陰性對照管相比較，以肉眼觀察10%培養物生長的最低藥物濃度孔作為觀察終點，其濃度為 MIC90值。

2 結果

按照正交試驗設計的提取方法進行嘎日迪-13有效成分的提取，得到9份嘎日迪-13有效提取物。通過對提取得到的各浸膏得率的計算及浸膏物質對白色念珠菌 MIC90值的研究分析，得出每個正交水平的有效部位得率及其對白色念珠菌MIC90值，分別計算各組試驗結果的綜合平均值 K1、 K11、K2 、K21和 K3、K31，極差 R1、R2，結果見表2。4個因素對嘎日迪-13提取物得率的影響大小順序為： B>D>A>C ，以得率為指標的最優水平組合為 B3D1A3C2，即20倍量50%乙醇溶液，加熱回流提取3次，每次 60min；4個因素對嘎日迪-13提取物 MIC90的影響大小順序為：D>A=B>C，以 MIC90為指標的結果為D2A1B2C2、D1A2B2C3、D2A2B3C1、D2A3B1C3、D3A3B2C1、D1A3B3C2等6組同樣顯示最佳抑菌效果。綜上所述，嘎日迪-13的最佳提取工藝為20倍量50%乙醇溶液，加熱回流提取3次，每次 60min 。見表2。

表2 嘎日迪-13最佳提取工藝直觀分析

3 小結

嘎日迪-13是從蒙藥方吉朱木道爾吉、嘎日迪-5、巴特爾-7、洪古日-12等"殺粘"蒙藥中篩選出抗白色念珠菌作用最強的處方。本試驗表明，篩選出的嘎日迪-13提取工藝具有抑制白色念珠菌的作用，MIC90為2mg/mL。