江西眼鏡蛇細胞毒素對白血病CEM細胞的抑制作用*

★ 周軍 朱金華 余雄英 朱大誠 潘榮斌 周紅 歐陽永偉（.江西中醫藥大學 南昌 330004；.南昌縣疾病控制中心 南昌 33000）

關鍵字：眼鏡蛇毒；細胞毒素；CEM細胞；抑制；細胞凋亡

眼鏡蛇毒細胞毒素（Cytotoxin，Cardiotoxin）是眼鏡蛇毒的主要毒性成分之一，約占粗毒總蛋白的40%左右［1］。大量研究表明眼鏡蛇細胞毒素對白血病腫瘤細胞具有較強的殺傷作用，這引起了國內外廣大生物毒素抗腫瘤科研工作者的極大興趣［2-8］。

急性T淋巴細胞白血病（T-cell Acute lymphoblastic Leukemia，T-ALL）是一類最常見造血干細胞惡性克隆性疾病，具有易復發，預后差的典型特征［9-10］。隨著醫療科技的高速發展，經過規范和強化治療，該病的兒童五年無病生存率顯著提高，達到70%～75%；然而成人患者的五年無病生存率僅有20%～50%［10］。究其原因，主要是臨床缺乏合適的治療藥物和方案，成人治療仍然還是按照兒童的治療方案進行治療［10-11］。針對這一情況，本研究采用從江西眼鏡蛇原毒分離純化的細胞毒素作用急性T淋巴細胞白血病CEM細胞株，應用CCK-8法觀察眼鏡蛇細胞毒素對CEM細胞的增殖抑制作用，并對其作用機制進行初步探索。本研究將為開發眼鏡蛇細胞毒素應用于臨床治療急性淋巴細胞性白血病提供理論依據。

1 材料

1.1 試驗藥物 江西眼鏡蛇細胞毒素（眼鏡蛇由江西省南豐縣洽灣蛇場飼養，經鑒定屬于中華眼鏡蛇（Naja naja atra）。眼鏡蛇原毒經CM-SephadexG50柱層析分離并經SP-SephadexG50柱純化、脫鹽、凍干后獲得，實驗室制備批號900622；詳細制備方法見參考文獻［12］）

1.2 細胞株 白血病CEM細胞，購自天津市中國醫學科學院血液學研究所，液氮保存。

1.3 試劑 RPMI1640培養基（Gibco），小牛血清（Gibco），PierceTMBCA Protein Assay Kit購 自美國Thermo Fisher公司；α-氰基-4-羥基肉桂酸，乙腈，三氟乙酸購自美國Sigma公司；CCK-8試劑盒（Dojindo）購自日本同仁化學研究所；Anti-Caspase-3 antibody［E87］（ab32351），Anti-Caspase-8 antibody［E6］（ab32125） 購 自 美 國Abcam 公 司；β-Actin（13E5）Rabbit mAb，Antirabbit IgG，HRP-linked Antibody購自美國CST公司，RIPA Buffer，PMSF購自碧云天公司。

1.4 儀器 CO2培養箱（美國Thermo Fisher公司）；Bio-Rad蛋白電泳轉膜系統（美國Bio-Rad公司）；Fluor Chem M凝膠成像系統（美國Protein Simple公司）；Spectra max plus 384酶標儀（美國Molecular device公司）；IX70-142熒光倒置顯微鏡（BX43顯微拍照系統，日本OLYMPUS公司）；4700 MALDITOF/TOF-MS（美國Apply Biosystems公司）。

2 方法

2.1 分子量的測定 取濃度為1mg/mL眼鏡蛇細胞毒素2μL等比例與基質CHCA［0.4mg/mLα-氰基-4-羥基肉桂酸（CHCA）溶液，溶劑為50%乙腈/0.1%三氟乙酸］混合，然后點于靶板上干燥結晶后，MALDI-TOF/TOF質譜儀分析獲得譜圖。

2.2 細胞培養與給藥 白血病CEM細胞培養于含15%小牛血清的RPMI1640培養液中，37℃，5%CO2，飽和濕度的細胞培養箱進行培養，每2天換液1次。取對數生長期細胞按每孔2×105個/mL接種90μL于96孔板，然后按每列每孔加入10μL不同濃度（濃度依次為80，40，20，10，5，2.5，1.25，0.625μM）的細胞毒素溶液（用培養基配制后0.22μm膜過濾）分別在6，12，24，48，72h。不加藥對照組只加等量RPMI1640培養液，空白對照組加RPMI1640和等量dH2O，每組設6個平行孔。實驗重復3次。

2.3 細胞增殖抑制率測定 在進行數據測定前1h，于96孔板每孔中加入10μL CCK-8進行孵育。孵育結束后，置于酶標儀上振蕩15s后450nm下測定吸光度（OD值）。細胞增殖抑制率=［1-（實驗組OD值-空白對照組OD）/（不加藥對照組OD值-空白對照組OD）］×100%

2.4 倒置顯微鏡觀察不同濃度對CEM細胞的影響 取實驗各組的細胞置于倒置顯微鏡下觀察24h后藥物對細胞的抑制效果并拍照。

2.5 細胞形態學觀察 將對數生長期的細胞分組，處理方法與培養時間參照細胞培養與給藥部分。分別取各實驗組細胞懸液離心涂片，用Giemsa染色，用蒸餾水洗滌，二甲苯透明后用中性樹脂進行封片保留至顯微拍照系統進行光鏡下觀察并拍照。

2.6 蛋白提取 取對數生長期的CEM細胞懸液，細胞計數終濃度3×105個/mL，分瓶，5mL/瓶，按照細胞培養與給藥部分處理方法處理細胞后，500g離心10min，去掉上清液，加入預冷pH7.4的PBS 5mL重懸細胞，500g再次離心10min，共洗滌2次以去除細胞懸液中的細胞碎片。將收集到的各組細胞各加入適量的RIPA裂解液（RIPA：PMSF=100：1）裂解細胞，在冰上裂解30min；收集細胞裂解液放入1.5mLEppendorf管中，4℃下15000g離心10min。取上清蛋白液，存于-80℃備用。

2.7 蛋白質濃度測定 蛋白濃度的測定使用BCA蛋白測試試劑盒。操作過程簡述如下：按等比配置好7個濃度的牛血清白蛋白（BSA）標準品和待測蛋白樣品，取各組蛋白樣品25μL分別加入到標記好的96孔微板中，向每孔中添加200μLBCA工作液，混勻后置于37℃培養箱中孵育30min，冷卻至室溫后，于562nm下在酶標儀上進行檢測。繪制蛋白標準曲線后代入待測樣品吸光度計算出待測樣品中的蛋白濃度。如果待測樣品濃度過大，需用PBS稀釋后再次測定。

2.8 Western Blotting檢測Caspase-3和caspase-8蛋白表達 取上述制備的細胞總蛋白20μg按10%聚丙烯酰胺凝膠蛋白電泳操作步驟加入相關試劑后加熱10min進行蛋白變性，上樣至預制膠中后進行電泳，電泳條件為恒壓200V，電泳時間為50min。電泳結束后進行濕轉，轉膜條件為恒壓70V，時間為90min，轉膜結束后，蛋白印記好的PVDF膜用TBS/0.1%Tween-20（TBST，pH 7.6）洗滌5min后置于封閉液（5%牛奶TBST溶液）室溫封閉1h，TBST洗滌3次，每次10min。爾后將膜置于一抗溶液（按一抗說明書比例進行稀釋）4℃慢搖孵育過夜。孵育結束后移除一抗溶液后，用TBST洗滌3次，每次10min。滴加二抗溶液（Anti-rabbit IgG，HRP-linked antibody，1∶2000稀 釋 于 5% 牛 奶TBST溶液中）室溫孵育1h后再次用TBST洗滌3次，每次10min，加入化學發光檢測試劑于暗光條件進行條帶顯色1min后置于凝膠成像系統中曝光檢測。以β-Actin為內參，檢測的條帶用Quantity One4.6.2軟件進行分析。

2.9 統計學處理 采用SPSS 22.0軟件分析。數據以均數±標準差（）表示，比較采用單因素方差分析；P＜0.05有統計學意義。

3 結果

3.1 江西眼鏡蛇細胞毒素分子量 經MALDITOF/TOF質譜儀分析獲得譜圖可知，本實驗室從江西眼鏡蛇原毒分離制備的細胞毒素分子量為6776.6Da，質譜圖見圖1。

圖1 江西眼鏡蛇細胞毒素的MALDI-TOF/TOF質譜分析圖

3.2 江西眼鏡蛇細胞毒素對CEM細胞增殖抑制率的影響 用細胞毒素作用CEM細胞后發現，細胞毒素在6h就對細胞產生明顯的抑制作用，且抑制率隨細胞毒素濃度的增加而增加；尤其在高劑量時抑制率增加明顯。而在使用相同濃度的細胞毒素作用細胞后發現，在高濃度時，隨著作用時間的延長，抑制率出現先增加后降低的變化趨勢；在作用24h時抑制率達到最大，此時IC50為1.613μM。而低濃度的細胞毒素隨作用時間的延長，抑制率反而降低。結果見表1。

表1 不同濃度江西眼鏡蛇細胞毒素對CEM細胞增殖抑制率的影響（，n=6）

表1 不同濃度江西眼鏡蛇細胞毒素對CEM細胞增殖抑制率的影響（，n=6）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05

時間/h抑制率/% IC50/μM 0.0625 0.125 0.25 0.5 1 2 4 8 6 13.7324.73*18.92*24.95*28.63 37.32 46.81*49.74*8.294 12 1.16 3.82 3.81 10.35 13.10*31.95*49.33*57.92*4.949 24 1.65 3.42 3.93 16.24 49.59*61.97*72.45*80.89*1.613 48 1.61 1.99 4.44 3.49 24.42*43.27*62.06*72.83*2.929 72 0.18 2.26*2.34 0.45 5.43 31.41*62.33*79.78*3.357

3.3 倒置顯微鏡觀察不同濃度眼鏡蛇細胞毒素對CEM細胞增殖的影響 倒置顯微鏡下觀察到，對照組細胞多且飽滿，大小均一，部分細胞有側凸，細胞折光能力很強（圖2A）；而用細胞毒素作用24h后，各給藥組細胞數目隨濃度的增加而有所減少，細胞變小而且折光能力也有不同程度下降（圖2B，2C，2D），尤其在高劑量組中，細胞折光能力改變更為明顯并且出現了大量細胞碎片（圖2D）。

圖2 不同濃度眼鏡蛇細胞毒素作用CEM細胞24h的影響（×200倍）

3.4 不同濃度眼鏡蛇細胞毒素對CEM細胞形態學的影響 光鏡下觀察到，對照組細胞著色深，大小基本一致，核大且核漿比例失調（圖3A）。在各給藥組CEM細胞體積明顯縮小，且與臨近細胞分離明顯（圖3B，3C）。在高劑量組，有些細胞出現胞膜皺縮，染色質凝聚成塊，甚至還個別細胞出現核膜裂解、染色質分割成塊狀，胞質外溢等典型凋亡細胞特征（圖3D）。

圖3 不同濃度眼鏡蛇細胞毒素作用CEM細胞24h的形態學變化（×400倍）

3.5 不同濃度眼鏡蛇細胞毒素對CEM細胞Capase-3、Capase-8蛋白表達的影響 與對照組相比，眼鏡蛇細胞毒素各濃度組的Caspase-3、Caspase-8蛋白表達均有增加，以高濃度（2μM）組增加明顯，見表2和圖4。

表2 不同濃度眼鏡蛇毒細胞毒素作用CEM細胞24h對Caspase-3、Caspase-8蛋白與內參β-Actin 蛋白表達比值（，n=6）

表2 不同濃度眼鏡蛇毒細胞毒素作用CEM細胞24h對Caspase-3、Caspase-8蛋白與內參β-Actin 蛋白表達比值（，n=6）

注：與對照組比較，*P＜0.05

組別 Caspase-3/β-Actin Caspase-8/β-Actin對照組 0.7499±0.0663 0.6610±0.0597 0.125μM 組 0.8926±0.1168 0.8717±0.1095 0.5μM 組 0.9251±0.0885* 0.9445±0.1602*2μM 組 0.9993±0.0643* 1.0045±0.1212*

圖4 不同濃度眼鏡蛇毒細胞毒素作用CEM細胞24h對Caspase-3、Caspase-8蛋白表達的影響

4 討論

本研究采用細胞毒素是從江西眼鏡蛇原毒分離純化的，經質譜分子量測定，發現和文獻［13-14］報道的細胞毒素分子量存在差異。這種差異產生的原因可能是由于眼鏡蛇所屬產地不同，其分泌的蛇毒細胞毒素存在種屬特異性差異；也有可能是分離純化方法不同而導致分離到不同的細胞毒素所造成的分子量差異。CCK-8試劑檢測其對CEM細胞作用的研究結果表明，該細胞毒素對CEM細胞在6h就產生抑制作用，而且抑制程度隨藥物濃度增加而增加；呈典型的劑量依賴性；而在同一濃度作用下，抑制作用隨時間延長呈現出先增加后有所降低的趨勢，最佳的作用時間在24h。此時，IC50為 1.613μM（10.93μg/mL），該 IC50值與文獻［14］報道相接近，但是與文獻［6］報道相差較大。我們認為造成這種差異的原因可能與細胞株類型、蛇毒細胞毒素類型等有關，具體原因有待進一步的研究。在抑制率結果分析中，需特別指出兩點：（1）在0.125μM細胞毒素作用CEM細胞6h時，平均抑制率達24.73%，該抑制率與0.5μM所產生的抑制率相當，我們無法解釋這一結果，需后續實驗進一步尋找原因。（2）細胞毒素在低濃度（0.25μM以下）時，隨著作用時間的延長，抑制作用迅速下降。分析產生這一現象的原因可能是由于細胞毒素本身屬于蛋白，當開始作用時，被抑制的細胞出現凋亡壞死后，細胞內含的蛋白水解酶類除可以將自身的蛋白降解以外，還可以將一定量的細胞毒素也降解；使得細胞毒素含量下降進而產生的抑制作用降低。這一解釋似乎也可以解釋為什么在細胞毒素作用CEM細胞48h乃至72h后，其抑制作用并沒有明顯增加，反而有所降低。當然，這種解釋需要進一步的實驗進行后續驗證。為進一步地驗證細胞毒素對CEM細胞的抑制作用，我們選擇在抑制作用效果最明顯的24h時進行倒置顯微鏡鏡下直接觀察。觀察結果也證實了江西眼鏡蛇細胞毒素對CEM細胞有抑制作用，且抑制作用與給藥劑量成正相關。

據目前的文獻報道，眼鏡蛇細胞毒素可通過細胞膜死亡受體、線粒體等相關凋亡途徑誘導細胞發生凋亡從而抑制白血病腫瘤細胞K562、U937、HL-60等增殖［2-8］。我們先對細胞毒素作用后的CEM細胞進行Giemsa染色，染色結果顯示有些細胞出現胞膜皺縮，染色質凝聚成塊，甚至還個別細胞出現核膜裂解、染色質分割成塊狀等典型凋亡細胞特征。進一步對Caspase-8、Caspase-3進行Western Blotting分析發現，江西眼鏡蛇細胞毒素可以促進凋亡啟動和效應蛋白Caspase-8、Caspase-3的表達。這些研究結果均提示江西眼鏡蛇細胞毒素也可通過誘導CEM細胞凋亡來發揮抑制作用；但江西眼鏡蛇細胞毒素是如何調控這些凋亡途徑來發揮抑制作用有待后續進一步地研究來闡明。

綜上所述，江西眼鏡蛇細胞毒素可以抑制CEM細胞增殖，其機制可能與其誘導CEM細胞凋亡有關。