基于補體C3及TGFβ1/Smad信號通路探究七氟烷麻醉對老齡小鼠突觸可塑性及工作記憶力損傷的機制

郄曉娟 李清開 劉穎 馮雪妍 霍修林 張秀寧 霍佳 李志華 于海磊 徐貫杰

河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院1麻醉科，2骨病科（石家莊 050051）；3 河北醫(yī)科大學法醫(yī)學院（石家莊 050011）

圍術期神經認知紊亂（perioperative neurocognitive disorders，PND）是老年患者術后常見的中樞系統(tǒng)并發(fā)癥之一，嚴重影響患者的恢復和生存質量［1］。七氟烷是目前常用的吸入性麻醉藥，文獻表明七氟烷可引起老齡大鼠持續(xù)的工作記憶障礙［2］。工作記憶作為一種高級的認知功能，依賴于神經元突觸間的復雜聯(lián)系，突觸連接是腦功能的結構基礎，其發(fā)生著持續(xù)、動態(tài)的變化，表現為在發(fā)育、應激、學習等過程中的可塑性［3-4］。突觸可塑性改變與七氟烷造成的認知能力下降有關［5］，但七氟烷造成突觸可塑性改變及工作記憶下降的機制尚不清楚。

補體系統(tǒng)是體內重要的免疫效應系統(tǒng)，由活化級聯(lián)反應中的血漿蛋白、膜調節(jié)蛋白和受體蛋白組成。大量證據表明補體系統(tǒng)在神經系統(tǒng)的發(fā)育及功能調節(jié)方面有重要作用［6］。補體分子C3 是補體級聯(lián)反應中的核心蛋白。海馬補體C3 信號通路的上調與手術后小鼠的認知功能受損相關［7］。研究發(fā)現C3 的激活與TGFβ1/smad 通路表達上調有關。TGFβ1/smad 通路表達上調，在多種中樞神經系統(tǒng)疾病中參與了認知功能的下降過程［8］。關于補體C3 介導TGFβ1/Smad 信號通路調控七氟烷引起小鼠認知功能下降的作用尚未明確，因此本研究旨在評估補體C3 及TGFβ1/Smad 信號通路在七氟烷麻醉對老齡小鼠突觸可塑性及工作記憶力損傷中的作用，為明確其機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物清潔級雄性C57BL/6 小鼠90 只，16 ～18月齡，體質量27 ～30 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司［許可證編號SCXK（京）：2021-0006］。室溫22 ～28 ℃，相對濕度40%～60%，晝夜循環(huán)，自由進食水。適應性喂養(yǎng)1 周后開展實驗。實驗得到我院的實驗動物倫理委員會批準（倫理號：KSD2022-042-1）。

1.1.2 主要試劑Trizol 購自美國英杰生命技術有限公司，反轉錄試劑盒購自美國伯樂公司，SYBR Green qPCR Master Mix 試劑盒購自寶生生物技術有限公司。RIPA 裂解液、BCA 試劑盒購自北京索萊寶公司，TGFβ1 抗體購自美國Abcam 公司，Smad3 抗體購自美國Abcam 公司，GAPDH 抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司，二抗兔IgG 購自武漢愛博泰克生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組將90 只C57BL/6 小鼠隨機分為3 組，對照組（C 組）、七氟烷麻醉組（S 組）和七氟烷麻醉+補體分子C3 抑制劑組（S+antiC3 組），每組30 只。

S 組和S+antiC3 組參照參考文獻［9］和預實驗結果制備七氟烷麻醉致小鼠工作記憶障礙模型。小鼠置于麻醉箱中，出氣端連接5350 型麻醉氣體監(jiān)測儀監(jiān)測七氟烷、氧氣和二氧化碳濃度，進氣端以純氧為載體連接七氟烷揮發(fā)罐（Drager 公司，德國）。箱底鋪墊少量鈉石灰防止二氧化碳蓄積。S組和S+antiC 3組吸入2%七氟烷（批號：21070531，上海恒瑞醫(yī)藥有限公司）2 h，C 組吸入純氧2 h。S+antiC 3 組參照文獻和課題組前期實驗在吸入七氟烷前30 min 腹腔注射0.25 mg CR2-Crry（靶向補體C3 抑制劑）。吸入七氟烷結束后，待其完全蘇醒后放回籠中。

1.2.2 Y 迷宮行為學測試正式實驗開始前4 d進行適應性訓練，將小鼠放入迷宮中央區(qū)任其自由活動8 min，連續(xù)3 d，每只小鼠活動結束后用75%消毒酒精噴灑迷宮以消除小鼠氣味。在麻醉前1 d、麻醉后3 d 和7 d 每組取10 只進行Y 迷宮行為學測試。正式實驗時，將小鼠頭部朝向起始臂末端擋板，將其放入起始臂自由探索8 min，同時記錄進臂總次數；計算小鼠正確自發(fā)交替率，小鼠身體完全進入宮臂記為有效進臂次數，連續(xù)3 次進入不同的臂則記為一次正確的自發(fā)交替，自發(fā)交替率=［正確進臂次數/總進臂次數-2）］×100% 。

1.2.3 長時程增強（long-term potentiation，LTP）將每組中隨機選取5 只小鼠，給予1%戊巴比妥鈉100 mg/kg 麻醉后固定在立體定向裝置中，局部注射2%利多卡因，安置刺激電極和記錄電極。刺激電極位于：bregma 后1.5 mm，中線右側旁開2 mm，記錄電極位于：bregma 后2.2 mm，中線右側旁開1.2 mm。給予0.033 Hz，0.1 ms 的電刺激，調試刺激強度直至得到最大幅度的群體峰電位（population spike，PS）幅度，波形穩(wěn)定后逐步下調刺激強度使PS 振幅降至最大PS 的50%左右，持續(xù)記錄30 min為基線。然后給予高頻刺激（high frequency stimulation，HFS）（200 Hz 的20 個脈沖刺激），每隔5 min記錄PS 振幅，共記錄60 min。用PS 增幅作為評測LTP 的指標，PS 增幅=［（HFS 后PS 幅度-HFS 前PS幅度）/HFS 前PS 幅度］×100%。

1.2.4 RT-PCR每組隨機選取5 只小鼠處死取海馬組織。使用引物見表1。采用Trizol 法提取RNA，PCR 儀上42 ℃加熱2 min，冰浴1 min。加入反應液置于37 ℃，15 min；85 ℃，5 s，取出反應液作為熒光定量的模板。單個RT-PCR 反應體系由5 μL SYBR Green Mix、1 μL 引物、1 μL cDNA 和3 μL DEPC水組成。擴增條件如下：95 ℃變性10 min，95 ℃10 s，60 ℃20 s，72 ℃25 s，40 個循環(huán)。反應結束后獲取循環(huán)閾值（Ct 值），使用2-ΔΔCt法進行相對定量分析。

表1 RT-PCR 引物序列Tab.1 RT-PCR Primer sequences

1.2.5 Western blot行為學實驗結束后，每組隨機選取5 只小鼠處死取海馬組織。加入RIPA 裂解液提取組織蛋白，BCA 試劑盒進行蛋白濃度定量，上樣，SDS-PAGE 電泳轉到PVDF 膜后，脫脂牛奶封閉。加入TGFβ1（1∶1 000，批號GR3412442-14）、Smad3（1∶1 000，批號GR169548-7）、GAPDH 抗體（1∶10 000，批號10494-1-AP），4 ℃冰箱過夜，次日取出，TBST 洗滌后加入二抗兔IgG（1∶3 000，批號10312942），室溫下放置2 h，使用凝膠成像系統(tǒng)掃描，Image J 軟件分析掃描結果。

1.3 統(tǒng)計學方法采用IBM SPSS 27.0 軟件進行數據統(tǒng)計分析，正態(tài)分布的計量資料以均數±標準差表示，組內比較采用重復測量方差分析，組間比較應用單因素方差分析，兩兩比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 3組小鼠的工作記憶能力指標的變化在麻醉前1 d、麻醉后3 d 和麻醉后7 d，3 組間進臂總次數差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與麻醉前1 d 比較，S 組麻醉后各時間點的自發(fā)交替率下降（P＜0.001）；與C 組比較，S 組麻醉后各時間點自發(fā)交替率下降（P＜0.001）；與S 組比較，S+antiC3 組麻醉后各時間點自發(fā)交替率增加（P＜0.001）。見表2。

表2 3 組小鼠不同時間點Y 迷宮實驗指標比較Tab.2 Comparison of Y maze text indexes at different time points of mice in three groups±s

表2 3 組小鼠不同時間點Y 迷宮實驗指標比較Tab.2 Comparison of Y maze text indexes at different time points of mice in three groups±s

組別C 組S 組S+antiC3 組F 值P 值進臂總次數（次）自發(fā)交替率（%）麻醉前1 d 33.42 ± 2.71 31.35 ± 2.21 32.98 ± 2.22 3.119 0.055麻醉后3 d 32.42 ± 2.53 34.12 ± 2.66 33.26 ± 2.78 0.769 0.470麻醉后7 d 32.52 ± 2.76 33.62 ± 2.61 32.48 ± 2.59 0.891 0.418麻醉前1 d 0.73 ± 0.13 0.74 ± 0.16 0.72 ± 0.15 0.0923 0.912麻醉后3 d 0.72 ± 0.12 0.47 ± 0.06 0.68 ± 0.13 23.252＜0.001麻醉后7 d 0.73 ± 0.14 0.55 ± 0.13 0.71 ± 0.11 9.012＜0.001

2.2 3 組小鼠海馬PS 增幅百分比的變化在麻醉后7 d 行LTP 水平檢測（根據參考文獻［10］和前期實驗的結果，選擇此時間點），發(fā)現給予HFS 后，5 ～60 min 記錄顯示，S 組和S+antiC3 組PS 增幅低于C 組，其中第60分鐘（HFS后30 min）時，C 組、S組和S+antiC3 組PS 增幅分別為（175.18 ± 8.62）%、（112.62±5.79）%和（162.60±6.73）%（F=109.567，P＜0.001），S組的PS增幅顯著低于C組（t=13.451，P＜0.001），S+antiC3 組的PS 增幅明顯高于S 組（t= 12.616，P＜0.001）。見圖1。

圖1 3 組小鼠海馬區(qū)LTP 水平的比較Fig.1 Comparison of LTP levels in hippocampal of mice in three groups

2.3 3 組小鼠海馬補體分子C1q 和C3 的mRNA的變化與麻醉前1 d 比較，S 組和S+antiC3 組的麻醉后各時間的C1q 和C3 的mRNA 明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）；與C 組比較，S 組麻醉后各時間點C1q 和C3 的mRNA 升高（P＜0.05），與S 組比較，S+antiC3 組麻醉后各時間點C1q 和C3的mRNA 降低（P＜0.001）。見表3。

表3 3 組小鼠不同時間點補體C1q 和C3 的mRNA 表達量比較Tab.3 Comparison of complement C1q and C3 mRNA expression at different time points of mice in three groups ±s

表3 3 組小鼠不同時間點補體C1q 和C3 的mRNA 表達量比較Tab.3 Comparison of complement C1q and C3 mRNA expression at different time points of mice in three groups ±s

組別C 組S 組S+antiC3 組F 值P 值C1q C3麻醉前1 d 1.01 ± 0.12 1.13 ± 0.17 1.09 ± 0.16 0.813 0.469麻醉后3 d 1.21 ± 0.20 1.69 ± 0.31 1.29 ± 0.23 5.429＜0.05麻醉后7 d 1.12 ± 0.17 2.36 ± 0.43 1.34 ± 0.23 24.619＜0.001麻醉前1 d 1.24 ± 0.16 1.33 ± 0.17 1.36 ± 0.19 0.646 0.542麻醉后3 d 1.26 ± 0.19 2.05 ± 0.34 1.62 ± 0.23 11.680＜0.05麻醉后7 d 1.28 ± 0.18 4.45 ± 0.52 2.07 ± 0.29 105.566＜0.001

2.4 3 組小鼠海馬TGFβ1、Smad3 蛋白的變化在麻醉后7 d 行TGFβ1/Smad3 通路蛋白水平檢測（根據前期實驗［11］和參考文獻，選擇此時間點）。與C 組比較，S 組和S+antiC3 組的TGFβ1 和Smad3蛋白表達明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）；與S 組比較，S+antiC3 組TGFβ1 和Smad3 蛋白表達明顯下降（P＜0.001）。見表4 和圖2。

圖2 3 組小鼠TGFβ1/Smad3 通路的變化Fig.2 Changes in TGFβ1/Smad3 pathway of mice in three groups

表4 3 組小鼠TGFβ1/Smad3 通路蛋白表達的比較Tab.4 Comparison of TGFβ1/Smad3 pathway protein expression of mice in three groups±s

表4 3 組小鼠TGFβ1/Smad3 通路蛋白表達的比較Tab.4 Comparison of TGFβ1/Smad3 pathway protein expression of mice in three groups±s

組別C 組S 組S+antiC3 組F 值P 值TGFβ1 0.61 ± 0.07 2.56 ± 0.23 1.13 ± 0.12 211.835＜0.001 Smad3 0.78 ± 0.09 2.45 ± 0.22 0.98 ± 0.11 181.844＜0.001

3 討論

本研究中采用2%的七氟烷麻醉2 h 制備小鼠認知功能障礙模型，發(fā)現采用Y 迷宮實驗評價嚙齒類動物工作記憶，自發(fā)交替率越低，說明工作記憶能力下降，進臂總次數差異無統(tǒng)計學意義，排除小鼠體力及視力對小鼠探索迷宮的影響，結果顯示，各組與C 組比較，S 組麻醉后各時間點自發(fā)交替率增加同時進臂總次數差異無統(tǒng)計學意義，提示老齡小鼠認知功能障礙模型制備成功。在七氟烷麻醉影響小鼠認知功能的文獻中［2］，對老齡小鼠使用2% ～3%七氟烷麻醉后1、3、7 d 出現持續(xù)的工作記憶下降，與上述研究結果一致。

吸入麻醉藥廣泛用于臨床麻醉，與PND 的發(fā)生有關［12］。海馬作為學習記憶的重要中樞，其突觸可塑性與學習記憶密切相關［13］。LTP 是評估海馬區(qū)突觸可塑性的關鍵指標，HFS 后PS 的增高幅度越大說明突觸可塑性越好［14］。LTP 在腦損害模型中呈遲發(fā)性抑制［10］，與其研究結果一致，在前期研究發(fā)現PS 增幅在七氟烷麻醉后1 d 抑制不明顯，故本研究選擇麻醉后7 d 的時間點進行LTP 試驗。本研究發(fā)現與C 組比較，S 組的PS 增幅顯著低于C 組，提示七氟醚引起海馬LTP 下降，海馬突觸可塑性減退。

大量的臨床研究結果表明，補體級聯(lián)通路的激活是中樞神經系統(tǒng)炎癥［15］、突觸功能障礙［16］、抑郁、認知功能障礙［17］等多種神經系統(tǒng)疾病的基礎。C1q 是補體級聯(lián)反應中的第一個分子，起到“識別”的作用［18］。C3 是下游的補體蛋白，是補體級聯(lián)反應中的核心蛋白［19］。在神經炎癥的阿爾茨海默病患者中，我們發(fā)現腦組織、腦脊液和血漿中的C1q 表達增高［20］。在本研究中結果顯示，與C 組比較，S 組C1q 和C3 的mRNA 升高，提示七氟烷引起了海馬區(qū)補體級聯(lián)反應的激活。補體C3是補體級聯(lián)通路的關鍵蛋白，抑制C3 可緩解冠狀病毒肺炎［21］、治療牙周炎［22］和陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿［23］等。在阿爾茨海默病中補體C3 的缺失可減少tau 病變，緩解神經炎癥、突觸缺陷和神經變性［24］。CR2-Crry 是改良的靶向補體C3 的抑制劑，在多種疾病中起治療作用［9］。研究表明，與S組比較，S+antiC3 組海馬C1q 和C3 的mRNA 降低、PS 增幅明顯增高和麻醉后各時間點自發(fā)交替率增加，提示七氟烷通過補體C3 通路致海馬突觸可塑性下降進而導致工作記憶水平下降。在小鼠脛骨骨折手術后海馬星形膠質細胞和小膠質細胞中C3水平表達明顯升高、突觸數量減少，引起認知功能下降，給外源性C3 加重了術后認知能力的下降，阻斷C3 可明顯改善海馬依賴的認知功能［7］，與本研究結果一致。

TGFβ1/smad 通路是細胞內多種病理過程中的共同信號通路，認為其過度激活參與了神經膠質瘤［25］和腦積水［26］等腦部疾病的發(fā)生。研究［27］表明TGFβ1 可誘導糖尿病腦病，抑制C3 可減少TGFβ1/smad 通路激活，緩解糖尿病小鼠海馬區(qū)神經元凋亡、突觸丟失以及認知功能下降的發(fā)生發(fā)展。由于補體C3 調控TGFβ1 通路，且PCR 實驗中，與C組比較，S 組在七氟烷麻醉后1 d，C1q 和C3 mRNA升高（P＜0.05）；在7 d，C1q 和C3 的mRNA 明顯升高（P＜0.001），故選取七氟烷麻醉后7 d 時間點行Western blot 實驗。本研究發(fā)現，與C 組比較，S 組的TGFβ1 和Smad3 蛋白表達明顯升高；與S 組比較，S+antiC3 組TGFβ1 和Smad3 蛋白表達明顯下降，提示七氟烷通過補體C3 介導的TGFβ1/samd 信號通路導致老年小鼠突觸可塑性和工作記憶水平的下降。

本研究尚存在不足之處在于：（1）僅做了補體C3 抑制的相關研究，未做補體C3 過表達的研究；（2）補體C3 介導TGFβ1/samd 信號通路的具體分子生物學機制有待進一步研究。

綜上所述，七氟烷麻醉可導致老齡小鼠工作記憶水平下降，其機制可能與補體C3 介導TGFβ1/smad 信號通路導致突觸可塑性下降有關。

【Author contributions】QIE Xiaojuan performed the experiments and wrote the article; LI Qingkai,LIU Ying,FENG Xueyan and HUO Xiulin collected and analyzed data and critically reviewed the intellectual content of articles; HUO Jia,YU Hailei,ZHANG Xiuning and LI Zhihua designed and performed the experiments, collected and analyzed data; XU Guanjie designed the study and reviewed the article, obtained research funding. All authors read and approved the final manuscript as submitted.