船舶壓載水取樣分析方法分析

成海濤 賈在明

經過IMO及航運界的不斷努力，《國際船舶壓載水及沉積物控制和管理公約》（以下簡稱《壓載水公約》）終于達到生效條件，并于2017年9月8日正式生效。但在公約實施過程中仍有各種矛盾和困難存在，實際操作中還有很多技術問題有待解決。例如，壓載水取樣分析方法與BWMS的型式認可取樣分析方法不一致，PSC檢查過程中的取樣分析方法沒有統一等[1]。

一、壓載水取樣分析現狀介紹

《壓載水公約》雖已生效，但仍處于經驗積累期（EBP）。經驗積累期實施過程分為三個階段：數據收集、數據分析和公約審議及修訂。國際海事組織海上環境保護委員會于2018年4月19日在倫敦召開第72界會議（MEPC72），會議對公約的EBP的數據收集和分析計劃（DGAP）時間表做了調整，要求于2019年匯總數據向MEPC74會議首次提交，于2022年向MEPC79會議提交關于公約修正的提案[2]。

經驗積累期需要收集眾多的數據，其中包括BWMS試用期間使用的取樣分析方法及結果。因此，PSC檢查過程中會出現兩種取樣分析的形式：

一種是為了收集數據而進行大量詳細分析的取樣，可稱為“自愿性取樣”，此種非強制的取樣分析結論不能作為判定船舶壓載水處理是否滿足D-2標準的依據。

另一種是依據《壓載水公約》第9條，港口國檢查中允許PSCO依據公約導則在必要的情況下進行的取樣分析，可稱為“強制性取樣”，此種取樣分析結論如證明船舶不符合公約要求，可以作為PSCO處罰船舶的依據[3]。

二、壓載水取樣分析方法

（一）檢測壓載水D-1標準的方法

1.壓載水置換標準D-1

《壓載水公約》D-1標準要求實施壓載水置換的船舶容量置換率應至少達到95%；泵流法置換的船舶，每個壓載艙應泵入3倍艙容的水量。壓載水置換水域應距離最近陸地至少200海里且水深至少200米；如船舶不能滿足上述要求時應距離最近的陸地至少50海里且水深至少200米；此外，港口國可指定船舶進行壓載水置換的水域。在規定的強制壓載水處理系統安裝日期前，現有船必須進行壓載水置換并滿足D-1標準[3]。

2.壓載水D-1置換標準的檢測方法

D-1置換標準不涉及壓載水內生物個體的定量規定，主要是驗證壓載水是否在深海開闊水域進行了有效置換。因此，檢測方法主要是依據沿岸水域與深海開闊水域的不同特點進行區分，一般從鹽度、濁度及含有機物等不同方面進行檢測分析，主要的方法有：

（1）鹽度分析法

由于淡水與河流匯入海中，導致沿岸水域鹽度一般較深海水域低。深海水域的鹽度一般都高于30 PSU，如果檢測壓載水的鹽度遠低于30 PSU則說明船舶可能沒有有效置換壓載水。實踐中一般使用電導計或鹽度計測量壓載水的鹽度。

應注意有些港口的鹽度與開闊深海水域相似，在這些港口壓載的船舶，不應將鹽度分析作為壓載水是否置換的唯一證據，應結合或使用其他的檢測方法。盡管如此，鹽度分析法仍不失為檢驗壓載水置換的一種較有效且簡便的方法[4]。

（2）有色可溶性有機物含量分析法

沿岸水域的另一特點明顯區別于開闊深海水域，即有色可溶性有機物（CDOM，Colored Dissolved Organic Matter）的含量，CDOM是一種在光學上可以測量的水中溶解有機物。CDOM含量高的壓載水在短波波段有強烈的吸收光譜，如藍色到紫外；CDOM含量低或不含CDOM的壓載水在長波波段有吸收，如紅色。因此，CDOM值高的壓載水顏色為綠色到黃綠色漸進到褐色，而CDOM值低的壓載水顯示出藍色[5]。

沿岸水域受人類活動影響比較大，如工業廢水、城市污水、農業活動排放廢水等，會使沿岸水域的CDOM值高；隨著離岸距離及水深的增加，CDOM值逐漸減小。通過使用三維熒光光譜（EEMS，Excitation/Emission Matrix Spectrometry）可以準確測出CDOM的閾值[5]。CDOM的閾值可以作為判斷船舶壓載水是否置換的有力證據，實踐中一般使用便攜式養分傳感器進行船舶壓載水CDOM閾值的檢測。

（二）檢測壓載水D-2處理標準的方法

1.壓載水D-2處理標準

在規定日期后，船舶必須安裝BWMS處理壓載水，并滿足D-2標準。公約規定的D-2標準要求如表1所示：

表1 船舶壓載水排放D-2標準[3]

2.壓載水D-2處理標準的檢測方法

壓載水D-2處理標準要求比較嚴格，需要對壓載水中的不同尺寸水生物進行定量檢測。其中細菌（有毒霍亂弧菌、大腸桿菌、腸道球菌）的檢測方法有相應的國際標準（ISO）可供參考，檢測壓載水時可直接引用；最小尺寸≥50微米的水生物一般為浮游動物，具有移動性（Mobility），可以通過立體顯微鏡直接計數法檢測[6]，結合活體染色（下文詳述）可以收到更好的效果，在壓載水檢測過程中基本得到認可[7]；最小尺寸≥10微米且<50微米的水生物一般不具移動性，通常為單細胞浮游植物，很難直接觀測計數[8]。采取的其他檢測方法有多種，同時存在的爭議也比較多，下面簡述對此類生物體的主要檢測方法：

（1）最可能數量連續稀釋培養法

最可能數量連續稀釋培養法（SDC，MPN method，The Serial Dilution Culture-Most Probable Number Method）是依據活的浮游植物具有繁殖能力來觀測壓載水中浮游植物細胞繁殖過程中葉綠素a的量變來計算細胞數量的方法。它是一種基于一系列稀釋樣本中浮游植物繁殖與不繁殖數據得分的二元計分數學運算。

SDC-MPN的做法是（如圖1所示）：

①取壓載水樣品，并進行連續的稀釋。

②將稀釋液樣品在營養液內及適宜的光照和溫度環境下培養。

③在培養的過程中，用標準實驗室熒光計監測稀釋液中的葉綠素熒光，活細胞會繁殖，葉綠素含量會增加，熒光信號也會增加。

圖1 SDC-M PN操作方法

④在培養前，如果稀釋液內有可繁殖活細胞，哪怕只有一個活細胞，都會繁殖導致葉綠素增加，顯示為熒光的增加，此份稀釋液計為“+”。

⑤同理，如果在培養前稀釋液內沒有活細胞繁殖，不會產生顯示熒光的增加，此份稀釋液計為“-”。

⑥利用稀釋倍數、稀釋液份數和每一次稀釋的正得分數進行MPN計算。

簡單理解SDC-MPN檢測法，就是在壓載水一系列的稀釋過程中，找出活體可繁殖浮游植物的消失點，進而反推出原始壓載水樣品中活細胞的數量。例如：如果可繁殖的活體細胞在10倍的稀釋液中檢測到，但在100倍的稀釋液中未檢測到，則原始樣品必須具有10至100個可繁殖活體細胞。通過稀釋倍數及MPN數學計算，可以確定更精確的結果[9]。

由于壓載水中最小尺寸為10～50微米的水生物一般為浮游植物，浮游植物為自養生物，能夠利用光能在其環境中從無機物中形成營養有機物質，進行繁殖，產生葉綠素。因此，SDC-MPN方法適用于壓載水中10～50微米大小的可繁殖浮游植物的有效檢測[10]。

（2）活體染色法

活體染色法（The Vital Stain Method）是使用適合監測細胞運動或定位的熒光素染色劑應用熒光顯微鏡來評估壓載水樣品中10～50微米大小的生物體的數量和狀態的方法。

常用的熒光素有二乙酸熒光素染色劑（FDA，Fluorescein Diacetate）和5-氯甲基熒光素染色劑（CMFDA-5，Chloromethylfluorescein Diacetate），CMFDA是FDA的氯甲基衍生物，這類熒光素染色劑也稱為“活細胞示蹤劑”。FDA已經被研究人員使用了幾十年，用于作為酶活性和活力的量度，包括細菌、硅藻、甲藻、綠藻、草本植物等，當熒光素染色劑被動進入細胞后，染色劑中的親脂性基團就會被活細胞中的非特異性酯酶水解，生成不滲透的熒光產物在細胞膜內保留下來[11]。但并非所有的生物都能被FDA染色，熒光信號常常不一致，CMFDA與FDA具有相同的熒光光譜，結合使用可以彌補這些缺陷。經過CMFDA標記的細胞產生可發出綠色熒光的5-氯甲基熒光素，熒光非常穩定，且可分配至兩個子代細胞中，進行細胞運動的多代追蹤[12]。

活體染色法對于檢測壓載水中的活體水生物比較有效，可以區分出細胞是“活的（Live）”或“死的（Dead）”。

（3）流式細胞術

流式細胞術（FCM， Flow Cytometry）是一種利用流式細胞儀對懸浮于流體中的微小顆粒進行計數、分析和分選的生物學技術。流式細胞術是醫學、化學及電子計算機科學等高度發展并綜合應用的高科技產物。先進的流式細胞儀可以高速分析成千上萬微小顆粒及細胞并可同時測得一個細胞的多個參數，將具有指定特性的顆粒有效區分并隔離[13]。

流式細胞儀的工作原理是對懸浮在液體中細胞或微粒進行熒光標記，使其流過光學或電子檢測器，通過熒光探測器捕獲檢測標記的熒光信號，并將熒光信號轉換成不同強度的電脈沖信號，經計算機處理形成相應的點圖、直方圖和加三維結構圖像進行分析，實現快速自動的細胞分選和收集。

流式細胞儀可以對壓載水中的≥50微米與≥10微米且＜50微米可生存有機體（包括異樣生物）的數目進行直接自動的評估，是當代最先進的細胞定量分析技術之一。

三、壓載水取樣檢測方法存在的不足

分析壓載水檢測方法存在的不足之前，需要明確目前迫切需要統一標準檢測壓載水的方法應具有哪些特點。從適用推廣的角度分析應具有以下特點：一是要經濟，檢測過程不能過于昂貴；二是操作應相對簡單，可以在全球范圍內推廣使用；三是短時間內即可獲得檢測結果，一般數小時，而不能是幾天，甚至幾周；四是現場可以檢測，不能必須帶到實驗室才能得到結果，這也是最重要的一點。結合以上特點分析壓載水檢測方法存在的不足如下：

1.D-1壓載水置換標準檢測方法存在的不足

D-1置換標準的檢測實施已久，技術方法也比較成熟，但仍存在不足，如：使用電導計和鹽度計測量鹽度法簡便快捷，但是指標檢測會受到溫度、壓力等外部因素的影響，以及港口水域鹽度較高時存在無法檢測的問題；使用CDOM含量分析法檢測比較可靠，但對檢測人員的素質要求較高，而且附著在壓載艙內壁在壓載水置換時無法排除的孢囊等有機體，會影響檢測結果的正確性[14]。

2.D-2壓載水處理標準檢測方法存在的不足

（1）最可能數量連續稀釋培養法存在的不足

SDC-MPN檢測方法被廣泛應用于浮游植物物種識別和計數已經超過50年，最近幾年才應用于列舉壓載水內總存活浮游植物的個數。如前所述，該方法對于檢測壓載水內可繁殖浮游植物是比較有效的。SDC-MPN檢測方法存在以下不足之處：一是對于不能進行人工培養繁殖的浮游植物以及異樣生物無法檢測；二是對于生長繁殖緩慢的浮游植物也很難檢測；三是耗時比較長，一般需要24小時到數月之久，而且會受到季節不同的影響[15]；四是需要培養專業的技術人員。

需要注意的是在申請BWMS的USCG型式認可時，USCG不認可SDC-MPN檢測法，而認可使用FDA/CMFDA活體染色法。原因在于USCG要求的壓載水處理標準高于IMO處理標準。IMO壓載水處理D-2標準計數的水生物為可繁殖新個體的水生物（Viable Organisms），而USCG的標準是活水生物（Living Organisms），SDC-MPN方法應用促進浮游植物增長繁殖來檢測，無法對不繁殖“活的（Live）”的水生物計數，因此USCG不認可此方法[4]。

（2）活體染色法存在的不足

CMFDA與FDA相結合的活體染色法（The Vital Stain Method）對于分析壓載水中的浮游生物（包括異養型生物）的確是較有效的方法。但此方法同樣存在一些問題：一是不同物種之間的染色強度不同，使得混合組合的評價容易出錯；二是受假陽性干擾，有些明亮物種的死細胞熒光性比暗物種的活細胞高，在區分活細胞時會產生錯誤；三是同樣需要專業的技術人員，尤其在排除假陽性干擾時，對顯微鏡師確定熒光閾值的要求較高[16]。

（3）流式細胞術存在的不足

流式細胞術（FCM）是當代最先進的細胞定量分析技術之一，使用流式細胞儀對船舶壓載水內有機體直接計數，既準確又可減少人工。不足之處是流體細胞計數成本比較高，且落后的國家和地區可能沒有此技術，同樣也需要專業的技術人員，全球推廣使用存在一定的困難[17]。

壓載水中最小尺寸≥10微米且＜50微米水生物的檢測方法除了這幾種以外，還有免疫熒光法及流式攝像機（根據葉綠素a和活體染色）檢測等，但每種方法都有其局限性，人員資質水平、儀器準確度等也會影響這些檢測結果的準確性。不同的壓載水檢測方法適用于不同原理的BWMS，MEPC71次會議通過的BWM.2/Circ.61推薦檢測方法如表2所示。

四、結束語

壓載水取樣分析存在很大的復雜性和技術局限性，對于船上的壓載水管理人員來說似乎更是無能為力。在IMO沒有確定統一標準的檢測方法之前，確定了“對先行者不處罰”的原則，但前提是必須可提供足夠的文件證明滿足不處罰的前提條件。美國對船舶壓載水管理更為嚴格，要求安裝BWMS的船舶在第一年強制要求進行兩次壓載水的取樣分析，根據分析結果確定下一年的取樣要求。因此，船上壓載水管理人員應在全面了解壓載水管理、具備專業的管理知識的基礎上，嚴格執行壓載水管理計劃及BWMS廠家的操作說明書和技術說明書等，盡量使PSC檢查停留在初始檢查階段。

表2 推薦壓載水檢測方法