K+ Concentration-Dependent Conformational Change of Pb2+-Stabilized G-quadruplex

YU Ze , LI Xiaohong ,＊, LI Yunchao ,＊, YE Mingfu

1 College of Chemistry, Beijing Normal University, Beijing 100875, P. R. China.

2 School of Chemistry and Chemical Engineering, Anhui University of Technology, Maanshan, 243002, Anhui Province, P. R. China.

Abstract: DNA can adopt a diverse range of structural conformations, including duplexes, triplexes, and quadruplexes. Among these structures, G-quadruplexes have attracted much more attention of researchers. For G-rich DNA sequences,they can fold into multiple G-quadruplex conformations, such as parallel,antiparallel, or hybrid, and the exact conformation is influenced by G-rich DNA sequence, strand concentration, and binding cations. Among the factors influencing the G-quadruplex conformation and stability, cations played a really important role. Numerous studies have reported cation-dependent stability and topological changes of G-quadruplexes; however, most of studies have focused on the effect of individual cation (such as charge, radii, or hydration, etc.), and only few have assessed the effect of competition between cations at different concentrations. Actually, most biological and aqueous systems contained multiple cations and each of the cations had very different concentrations. Thus, investigation of the competitions between different cations (at different concentrations) for binding with G-quadruplexes and their effects on polymorphism of G-quadruplex is critical, which would improve our understanding of the roles of G-quadruplexes and assist us in further exploring their potential applications in biochemical, biomedical, and environmental systems. Under this situation, we focused on K+- and Pb2+-stabilized G-quadruplex, two major cations that are usually used to stabilize G-quadruplex. It has been shown that for a given G-quadruplex forming DNA sequence,Pb2+-stabilized G-quadruplex was more stable than K+-stabilized G-quadruplex, and Pb2+ could substitute K+ in K+-stabilized G-quadruplex. However, the concentrations of K+ that allow such a substitution are not completely studied.Previous studies have used G-quadruplex-based fluorescent, colorimetric, and electrochemical sensors for detecting Pb2+,and these methods show excellent selectivity for Pb2+ over K+. Although G-quadruplex-based Pb2+ sensors were developed, their applications in real samples containing K+ were greatly limited. Thus, how K+ and Pb2+ compete for binding to G-quadruplex and how K+ concentrations affect the stability of Pb2+-stabilized G-quadruplex remain elusive. In this study, eight G-rich DNA sequences were selected to investigate the effect of K+ concentration on Pb2+-stabilized G-quadruplex. Previous studies have established that the presence of K+ cannot alter the stability of Pb2+-stabilized G-quadruplex. In contrast to this, our results indicated that K+ could induce a conformational switch in Pb2+-stabilized T2TT (G-rich DNA sequence, forming G-quadruplex in the presence of Pb2+), and further replace Pb2+ in Pb2+-stabilized T2TT and transform it into 2K+-stabilized T2TT, which is strictly K+ concentration-dependent. Importantly, such a conformational switch could be observed for other seven selected G-rich sequences as well. Therefore, our findings provide a new insight into the exchange and competition of cations in G-quadruplex.

Key Words: Lead ion; Potassium ion; G-quadruplex; G-rich DNA sequence; Conformational switch

1 引言

G-四鏈體(G4)是由陽離子誘導富G核酸適體鏈形成的DNA二級結構1。人體中有大量的富G序列，主要分布于端粒和原癌基因啟動子區域，這些序列與細胞調控過程緊密相關2。另外，目前已有許多人工合成的富G序列用于設計發展納米材料和分子器件3–14。G4的結構與性質直接影響到其在體內的生物功能和體外的生化應用。其中，金屬離子誘導富G核酸適體鏈形成G4的結構穩定性，是決定G4性質和功能的主要因素之一，因此，金屬離子誘導富G適體鏈形成G4的構型研究廣受關注15,16。

近年來，關于離子依賴的G4穩定性和拓撲結構的變化，一部分集中于單一離子的影響17–24，一部分集中于共存離子的影響25–28。基于在生物體系以及大部分的水相體系均含有不同濃度和不同種類的離子，研究共存離子對G4結構和性質的影響更具有普遍的科學意義。據相關報道，相比于K+穩定的G4結構(K+-G4))，Pb2+穩定的G4結構(Pb2+-G4)具有良好的結構穩定性17–19,22,29–38。因此，基于Pb2+不可逆地置換K+-G4中的K+，相繼報道了一系列的離子檢測傳感器34,38–41以及邏輯器件31,32,37。然而，在這些研究工作中，均未考慮K+對Pb2+-G4構型和穩定性的影響。

在本文中，通過系統地研究不同濃度鉀離子對穩定Pb2+-G4構型的影響，發現K+不僅會改變Pb2+-G4的構型，而且會置換其結構中的Pb2+進而形成K+-G4，這一影響表現出K+濃度依賴性。進一步研究發現，對于不同的富G適體鏈，這一轉化規律具有一定的普適性。研究結果闡明了Pb2+-G4的結構穩定性對K+濃度的依賴性。

2 實驗部分

2.1 實驗試劑

實驗中使用的 DNA由上海生工生物有限公司合成，具體序列如下所示：

T2TT: 5’-GGGTTGGGTGGGTGGG-3’

PW17 (PW17212): 5’-GGGTAGGGCGGGTT GGG-3’

PW17111: 5’-GGGAGGGCGGGTGGG-3’

PW17211: 5’-GGGTAGGGCGGGTGGG-3’

PW17222: 5’-GGGTAGGGCTGGGTTGGG-3’

TBA: 5’-GGTTGGTGTGGTTGG-3’

Oxy28: 5’-GGGGTTTTGGGGTTTTGGGGTT TTGGGG-3’

PS2.M: 5’-GTGGGTAGGGCGGGTTGG-3’

三羥甲基氨基甲烷Tris，高氯酸鉀，氯化鉀，三水合高氯酸鉛，均購于Sigma-Aldrich公司，并可直接使用。冰醋酸購于北京化工廠，并可直接使用。所有試劑均為分析純，使用之前不再經過任何純化。實驗過程中用水均為Millipore Milli-Q system (Thermo Scientific EASYpure)微孔過濾器過濾后的去離子水(電阻率為18.2 M?·cm)。

DNA母液的配制：用10 mmol·L-1Tris-HAc緩沖溶液(pH = 8.0)配制 100 μmol·L-1DNA，不同濃度的DNA溶液用10 mmol·L-1Tris-HAc緩沖溶液(pH = 8.0)稀釋可獲得。

2.2 圓二色光譜法

室溫 25 °C下，用 Chirascan型圓二色譜儀(Applied Photophysics Ltd)測量 4 μmol·L-1DNA 與10 μmol·L-1鉛離子(作用 1 h)的圓二色光譜；隨后，再考察加入不同濃度鉀離子(作用 1 h)的圓二色譜。測試液定容 1000 μL，4 μmol·L-1DNA 用 100 μmol·L-1DNA 母液稀釋獲得，將 Pb(ClO4)2母液用緩沖溶液稀釋至 100 μmol·L-1，后加 100 μL 至DNA中，不同濃度的鉀離子用濃度為50 mmol·L-1KClO4溶液作為母液進行稀釋獲得，剩余體積的反應液為緩沖溶液，反應液加至 1000 μL后用混勻器使其充分混勻，靜止使其充分反應后測圓二色譜。比色皿光路長度為1 cm，體積為800 μL。測試過程中通入高純氮，掃描范圍為 220–340 nm，每個測試波長的停留時間為 0.5 s，每個樣品重復測試兩次，最終譜圖需扣除測試緩沖液的背景。

2.3 電噴霧離子化質譜法

質譜樣品配制：如上述樣品配制，先配置 4 μmol·L-1的 DNA 樣品，在進入質譜檢測前加入TMAA (最終為 100 mmol·L-1和甲醇(最終為 20%)。質譜條件：電噴霧電壓 2.5 kV，毛細管溫度為150 °C。HPLC 作為自動進樣器，流速 2.50 μL·min-1。所得結果使用ProMass軟件解卷積處理。

3 結果與討論

據報道，10 μmol·L-1Pb2+可以誘導富 G 的核酸適體鏈形成G-四鏈體結構(G4)6–9。以T2TT適體鏈為例，以圓二色光譜表征其在Pb2+和K+存在條件下的構形轉化。如圖1a所示，在10 μmol·L-1Pb2+存在條件下，T2TT在310 nm處，出現一個正峰；同時，在260 nm處出現一個正峰，在243 nm處出現一個負峰，表明 T2TT適體鏈在 Pb2+的誘導下形成了雜合結構的G429,30,32,34,39,41–43。隨后，在該體系中，逐漸加入0到1 mmol·L-1K+，可以觀察到：(1) 在310 nm處的正峰逐漸減弱并向短波方向移動；(2) 在260 nm處的正峰逐漸增強并向長波方向移動至265 nm處；(3) 在243 nm處的負峰，逐漸增強。結果表明，隨著K+濃度的逐漸增加，Pb2+穩定的T2TT所形成的G4結構，逐漸轉化為平行的 G4結構。當 K+的濃度達到 1 mmol·L-1時，平行的 G4 特征峰與單獨 1 mmol·L-1K+存在條件下的G4特征峰相同，如圖1b所示。隨后，采用電噴霧離子化質譜(ESI-MS)進一步表征 T2TT 適體鏈分別在 10 μmol·L-1Pb2+，1 mmol·L-1K+，以及 10 μmol·L-1Pb2+和 1 mmol·L-1K+條件下所形成G4結構中內嵌離子的種類，結果如圖 1c所示。在 10 μmol·L-1Pb2+存在條件下，T2TT適體鏈質核比為5312 (5105 + 207)，對應于Pb2+誘導T2TT形成的G4結構；隨著K+濃度的增加，質核比為5312處的特征峰逐漸降低，并在質核比為5182 (5105 + 39 + 39)處出現了一個新峰且逐漸增加，對應于K+誘導T2TT形成的G4結構。當 K+濃度達到1 mmol·L-1時，質核比為5312處的特征峰完全消失。由此可以推測，K+取代了G4結構中的Pb2+。據文獻報道，Pb2+穩定的G4結構(Pb2+-G4)，其熱力學穩定性要高于 K+穩定的 G4結構(K+-G4)3–21，因此Pb2+可以置換K+-G4結構中的K+，但是K+的存在并不影響Pb2+-G4的穩定性。這一研究結果進一步說明，K+的存在不僅影響了 Pb2+-G4結構的構型和穩定性，而且還可以置換出Pb2+-G4結構中的Pb2+。

圖 1 4 μmol·L-1 T2TT (a)在 10 μmol·L-1 Pb2+以及不同濃度鉀離子(0.02–1 mmol·L-1)加入到 10 μmol·L-1 Pb2+體系中的圓二色譜圖（由紅到紫）；(b) 1 m mol·L-1 K+加入到 10 μmol·L-1 Pb2+體系中(黑線)與單獨 1 mmol·L-1 K+存在條件下(紅線)的圓二色譜圖；(c) 10 μmol·L-1 Pb2+以及 10 μmol·L-1 Pb2+穩定后加入不同濃度 K+以及單獨1 mmol·L-1 K+存在條件下的質譜圖Fig. 1 (a) CD spectra of 4 μmol·L-1 T2TT in the presence of 10 μmol·L-1 Pb2+ and adding K+ (0.02 to 1 mmol·L-1) to 10 μmol·L-1 Pb2+ system (from red to purple); (b) CD spectra of adding 1 mmol·L-1 K+ to 10 μmol·L-1 Pb2+ system(black) and that in the presence of only 1 mmol·L-1 K+(red); (c) ESI-MS of T2TT in the presence of 10 μmol·L-1 Pb2+with the subsequent addition of different concentrations of K+ (0.02 to 1 mmol·L-1), and in the presence of only 1 mmol·L-1 K+ (from top to bottom).

為了研究這一轉化規律的普適性，將核酸適體鏈擴展到其他的適體鏈，如 PW17212，以及PW17212的衍生序列(通過變化富G單元之間的堿基個數)，如PW17111(富G單元之間堿基個數為1)，PW17211和 PW17222，分別研究在 Pb2+，K+以及 Pb2+和 K+同時存在的情況下，G4結構的構型轉化。

10 μmol·L-1的鉛離子誘導 4 μmol·L-1PW17212(核酸適體鏈)發生構型轉變，結果如圖 2a所示。在圓二色圖譜中，在310 nm處出現一個正峰，在265 nm處出現一個負峰，對應于反平行G4結構的特征峰。由此可以推斷，10 μmol·L-1的鉛離子誘導 4 μmol·L-1PW17212形成了反平行的 G4 結構(Pb2+-PW17212)。隨后，在該體系中，逐漸加入0–20 mmol·L-1K+，反平行 Pb2+-PW17212結構在 310 nm處的正峰和在265 nm處的負峰逐漸減弱；相應地，在265 nm處的正峰逐漸增強，呈現出了平行 G4結構的特征峰。當 K+的濃度增加到 20 mmol·L-1時，Pb2+-PW17212的構型完全轉化為平行的 G4，此時的 G4圓二色特征峰與單獨 20 mmol·L-1K+誘導 4 μmol·L-1PW17212形成平行的G4 (K+-PW17212)特征峰基本吻合。接著，將核酸適體鏈由 PW17212變化成 PW17111、PW17211、PW17222，在同樣的條件下，研究K+對Pb2+-G4構型的影響。對于 PW17111(圖 2b)，Pb2+-PW17111是一個部分反平行的G4結構，隨著K+的不斷加入，反平行的特征逐漸減弱，平行的特征逐漸增加。當K+濃度達到0.5 mmol·L-1時，部分反平行的Pb2+-PW17111完全轉化為平行的G4結構。對于PW17211(圖2c)，Pb2+-PW17211是一個反平行的G4結構，隨著K+的不斷加入，反平行的特征逐漸減弱，平行的特征逐漸出現，并不斷增強。當K+濃度達到2 mmol·L-1時，反平行的Pb2+-PW17211完全轉化為平行的G4結構。對于PW17222(圖2d)，Pb2+-PW17222是一個反平行的 G4結構，隨著 K+的不斷加入，反平行的特征逐漸減弱，平行的特征逐漸出現，并不斷增強。當 K+濃度達到 50 mmol·L-1時，反平行的 Pb2+-PW17222完全轉化為平行的G4結構。由實驗結果可以看出，對于一系列的PW17適體鏈，因富G單元之間堿基數的不同，雖然K+均可以誘導Pb2+-G4發生構型轉變，但是需要K+的濃度，則各不相同，隨著富G單元間堿基個數的增加，發生構型轉變需要K+濃度的閾值逐漸增加。在保持富G重復單元保持不變的情況下，通過變化富G重復單元之間的堿基個數，發現K+依然可以誘導Pb2+-G4發生構型轉化。

圖 2 PW17212 (a)以及 PW17111 (b)、PW17211 (c)和 PW17222 (d)在 10 μmol·L-1 鉛離子和向 10 μmol·L-1 鉛離子穩定G4中加入不同濃度(mmol·L-1)鉀離子的圓二色譜圖Fig. 2 CD spectra of PW17212 (a), PW17111 (b), PW17211 (c) and PW17222 (d) in the presence of 10 μmol·L-1 Pb2+and adding different concentration of K+ to 10 μmol·L-1 Pb2+ system.

圖 3 4 μmol·L-1 TBA (a)、PS2.M (b)和 Oxy28 (c)在 10 μmol·L-1 Pb2+ (藍線)、10 mmol·L-1 K+ (紅線)和向 10 μmol·L-1鉛離子穩定G4中加入10 mmol·L-1 K+ (紫線)的圓二色譜圖Fig. 3 CD spectra of 4 μmol·L-1 TBA(a), PS2.M (b) and Oxy28 (c) in the presence of 10 μmol·L-1 Pb2+ (blue), in the presence of 10 mmol·L-1 K+ (red) and adding 10 mmol·L-1 K+ to 10 μmol·L-1 Pb2+ system (purple).

最后，將適體鏈擴展到不同的富G重復單元，如含有兩個G的重復單元TBA (圖3a)，含有三個G的重復單元PS2.M (圖3b)，含有四個G的重復單元 Oxy28 (圖3c)。對于TBA適體鏈，如圖3a所示，在 10 μmol·L-1鉛離子存在條件下，TBA 形成反平行的G4結構，在10 mmol·L-1K+存在條件下，形成平行的G4結構，在反平行的G4體系中，加入10 mmol·L-1K+，反平行的G4構型轉化為平行的G4構型。對于PS2.M適體鏈，如圖3b所示，在10 μmol·L-1鉛離子存在條件下，PS2.M形成反平行的G4結構，在反平行的G4體系中，加入10 mmol·L-1K+，反平行的G4構型轉化為平行的G4構型。對于Oxy28，如圖3c所示，在10 μmol·L-1鉛離子存在條件下，Oxy28形成反平行的G4結構，在10 mmol·L-1K+存在條件下，形成平行的G4結構，在反平行的G4體系中，加入10 mmol·L-1K+，反平行的G4構型轉化為平行的G4構型。由此可以看出，對于含有不同富G重復單元的適體鏈，依然可以觀察到K+誘導Pb2+-G4的構型轉化。

4 結論

綜上所述，K+不僅可以誘導Pb2+穩定G-四鏈體(Pb2+-G4)發生構型轉化，而且會進一步取代Pb2+-G4中的 Pb2+形成 K+-G4，構型轉化后的 G4結構與單獨K+誘導適體鏈形成K+-G4的構型基本一致。這種構型轉化以及離子取代過程具有鉀離子濃度依賴性。重要的是，這一轉化趨勢具有一定的普適性，與適體鏈中富G重復單元中G堿基的個數，以及與富G重復單元之間的堿基個數關系不大。上述研究結果為研究G四鏈體構形轉化和內嵌離子交換提供了新的視角，也為拓展 G4在生物分析和生化應用提供了新的理論基礎。