肺癌患者外周血單個核細(xì)胞microRNA 表達(dá)譜的研究

呂永強(qiáng)

（解放軍第210醫(yī)院，遼寧 大連 116021）

肺癌起病隱匿，部分患者在確診時已經(jīng)是癌癥中期甚至是晚期，5年生存率約為15%，但早期診斷患者，5年生存率卻明顯比中晚期患者高，約為49%。由此可見，早期診斷對提高肺癌患者生存率有重要意義[1]。肺癌特異性標(biāo)志物的識別與檢測比較困難，且少有標(biāo)志物能夠?qū)崿F(xiàn)快速檢測，因此臨床對肺癌與外周血PBMC microRNA之間關(guān)系的研究也越來越重視，以期實(shí)現(xiàn)早期診斷[2]。本研究中，擇取我院收治的肺癌患者和健康體檢者作為研究對象，探究肺癌患者PBMC microRNA表達(dá)譜的變化價值，現(xiàn)作如下報道。

1 資料與方法

1.1 一般資料：擇取2016年2月至2017年2月我院收治的肺癌患者53例作為研究組，所選患者均經(jīng)過病理檢查后確診，并未接受生物治療或放化療，其中男性23例，女性30例，年齡最大為77歲，最小為35歲，平均年齡為（62.5±5.6）歲，鱗癌35例，腺癌18例；另擇取同期健康體檢者53名作為對照組，經(jīng)過身體檢查結(jié)果顯示為健康狀態(tài)，其中男性25例，女性28例，年齡最大為75歲，最小為33歲，平均年齡為（62.8±5.9）歲。兩組患者各項(xiàng)資料數(shù)據(jù)對比結(jié)果提示無統(tǒng)計學(xué)差異，可以進(jìn)行比較。

1.2 方法：通過液態(tài)芯片技術(shù)并輔助RNA-DNA嵌合探針檢測兩組PBMC microRNA表達(dá)譜變化情況。檢測方法：先取靜脈血5 mL，并在1 h之內(nèi)提取單個核細(xì)胞，將RNA抽取出來，保存于-80 ℃條件下。操作步驟：先提取Total RNA。依據(jù)正常操作程序通過Ficoll提取外周血單個核細(xì)胞，并將1 mL Trizol加入其中進(jìn)行溶解處理。然后按照Trizol試劑操作程序，逐步提取單個核細(xì)胞總RNA，并對其吸光度進(jìn)行測量，使A260與A280之間的比值范圍保持在1.9～2.1，確保最低濃度為2.5 ng/L，保存于-80 ℃冰箱中。最后通過PNA-DNA嵌合探針液態(tài)芯片檢測microRNA，每份樣本均檢測3次。

1.3 檢測結(jié)果計算方法：在完成檢測工作之后，以miR-103為內(nèi)參，利用xMAP技術(shù)，將3次檢測所得數(shù)據(jù)的均值作為內(nèi)參照數(shù)值，計算公式如下：靶miRNA分子平均熒光強(qiáng)度與對應(yīng)本底平均熒光強(qiáng)度差值/有效內(nèi)參平均熒光強(qiáng)度與對應(yīng)本底平均熒光強(qiáng)度差值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法：采用SPSS22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理、分析，進(jìn)行t或卡方檢驗(yàn)，P＜0.05，差異明顯，具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

研究組PBMC各表達(dá)量檢測結(jié)果均比對照組高（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組PBMC各表達(dá)量檢測結(jié)果比較（）

表1 兩組PBMC各表達(dá)量檢測結(jié)果比較（）

miR-216 20.92±0.58 10.95±0.42 101.358 0.000 miR-31 1.68±0.03 0.62±0.03 181.889 0.000 miR-222 4.08±0.01 0.76±0.01 1709.075 0.000 miR-372 14.64±0.02 0.33±0.03 2889.388 0.000 miR-20a 1.44±0.09 0.23±0.02 95.546 0.000 miR-21 5.08±0.03 3.08±0.03 343.188 0.000 miR-145 5.34±0.01 1.68±0.03 842.595 0.000

3 討 論

microRNA是可以調(diào)控其他基因表達(dá)的非編碼小分子RNA，廣泛存在于各種有機(jī)體中。同時，在肺癌發(fā)生、發(fā)展期間，microRNA受到廣泛關(guān)注，其不僅可以調(diào)控肺癌生長，還對肺癌轉(zhuǎn)移和侵襲有一定作用，所以臨床診斷中，其對肺癌診斷有重要意義[3]。在本次研究中，通過對比肺癌患者與健康體檢者之間的PBMC microRNA 表達(dá)譜的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肺癌患者miR-216、miR-31、miR-222、miR-372、miR-20a、miR-21、miR-145表達(dá)量均比正常體檢者高，這與一般研究[4]結(jié)果相同，說明這一指標(biāo)與肺癌之間關(guān)系密切。

對于肺癌miRNA的檢測或其他特定細(xì)胞miRNA的檢測，檢測方法包括很多種，如實(shí)時熒光定量PCR、基因芯片、生物信息學(xué)方法、磁珠陣列等。本研究中對肺癌患者PBMC microRNA 表達(dá)譜變化的檢測采用是液態(tài)芯片技術(shù)并輔助RNA-DNA嵌合探針技術(shù)，此種檢測技術(shù)的關(guān)鍵在于將熒光染料染色或大小有差異的基苯乙烯小球通過特定抗體/抗原、探針進(jìn)行檢測，完成檢測后再利用流式細(xì)胞檢測類儀器作出分析。通過此種方式對PBMC microRNA表達(dá)量進(jìn)行檢測，不僅具有較高的可重復(fù)性，而且具備較高的準(zhǔn)確性，對確保診斷結(jié)果準(zhǔn)確有利[5]。為臨床疾病診斷中microRNA的應(yīng)用提供了有效方式，另外也給臨床診斷提供了可靠依據(jù)。雖然特異性的microRNA標(biāo)志物可以作為癌癥患者診斷的依據(jù)，但不同的癌癥患者，僅通過一種標(biāo)志物對腫瘤分期進(jìn)行判斷顯然可靠性還不足。伴隨醫(yī)學(xué)技術(shù)的進(jìn)步和發(fā)展，microRNA檢測將更加快捷和容易，且經(jīng)濟(jì)性也將提高。因血清容易獲得，所以血清microRNA相對穩(wěn)定，其優(yōu)勢也更加明顯。為使肺癌患者早期診斷率提高，血清microRNA檢測將逐漸發(fā)展成為重要檢測指標(biāo)，但也需要加深臨床研究和實(shí)踐，將microRNA在臨床診斷中的價值和意義充分體現(xiàn)出來，為肺癌診斷提供參考[6]。

綜上所述，肺癌患者PBMC microRNA 表達(dá)譜的變化與其病情變化之間存在緊密聯(lián)系，microRNA在肺癌早期診斷中的應(yīng)用具有顯著臨床價值，臨床研究應(yīng)引起重視。