淫羊藿苷對神經細胞缺血再灌注損害的保護作用及其作用機制分析

趙丹陽

（遼寧省沈陽市第一人民醫院神經內科，遼寧 沈陽 110041）

腦缺血性疾病是嚴重危害人類健康的常見病和多發病。研究發現，在腦缺血后的幾個小時內，缺血半暗帶或梗死區周圍的神經細胞死亡主要以凋亡為主[1-2]。淫羊藿苷是從小檗科淫羊藿屬植物中提取的有效成分，是一種黃酮醇苷類化合物，具有增加腦血流量、改善冠狀動脈循環、調節免疫、抗細胞凋亡等作用，但是該藥物對缺血缺氧誘導的神經細胞凋亡的機制尚不清楚。因此，為了能夠更好的掌握該藥物的作用機制，本文主要針對神經缺血再灌注損害中采用淫羊藿苷醫治的保護作用展開探討。具體報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料：本研究需要3只清潔級昆明小鼠孕婦。其他所需的材料有純度＞98%的淫羊藿苷、多聚賴氨酸、四甲基偶氮唑藍以及用于LDH和ROS檢測的試劑盒。淫羊藿苷在準備使用時運用少量的無水乙醇助溶，在沸水中進行水浴加熱，并在使用時進行稀釋，稀釋采用生理鹽水，最終使得淫羊藿苷的濃度表現為3.2 mg/L、1.6 mg/L、0.4 mg/L。

1.2 方法：將孕鼠采取斷頸的方式處死后對其進行消毒，消毒時采用75%的乙醇浸泡的方式，消毒所用時間為5 min，之后將鼠的兩側子宮取出，將其剪開并將胎鼠取出。取出后將顱骨剪開并取出腦組織。隨后進行凋亡檢測，主要有流式技術檢測細胞凋亡、Western blot/ realtime PCR檢測Bcl-2，Bax，caspase-3/8/9、免疫熒光細胞檢測。在完成上述檢測后進行PI3K/AKT及JNK通路檢測Western blot:AKT蛋白檢測，檢測過程中運用PI3K/AKT抑制劑LY294002、JNK抑制劑SP600125。

表2 對比各組單胺類遞質和氨基酸類神經遞質的含量（）

表2 對比各組單胺類遞質和氨基酸類神經遞質的含量（）

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1.3 觀察指標：本次研究的觀察指標為對比各組細胞的存活率，以及對比各組細胞外液的LDH和細胞ROS水平。

1.4 統計學方法：這次研究中各項與所選取患者相關的數據都導入到SPSS18.0中進行處理，使用平均值±標準差的形式來表示計量資料，t作為檢測指標，計數資料則使用百分數的形式來表示，卡方作為檢測指標，其中P＜0.05時證明數據之間具有明顯的差異存在。

2 結 果

2.1 對比各組細胞的存活率：對本次研究所得數據采用統計學方法進行分析，數據顯示，正常對照組的所有細胞均存活，細胞存活率高達100.0%。中劑量淫羊藿組的細胞存活率為83.7%、高劑量淫羊藿苷組的細胞存活率為81.5%，低劑量淫羊藿苷組的細胞存活率為67.8%。OGD模型組的存活率為51.0%。正常對照組和高、中、低劑量淫羊藿組的細胞存活率均明顯高于OGD模型組，組間數據差異具有統計學意義（P=0.001，χ2=6.082、11.082）。

2.2 對比各組的細胞外液LDH和細胞ROS水平：對本次研究所得數據采用統計學方法進行分析，數據顯示，高、中、低劑量的淫羊藿組和OGD模型組的細胞外液LDH和ROS水平明顯高于正常對照組，各組數據對比，差異存在統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 對比各組細胞外液LDH和細胞ROS水平（）

表1 對比各組細胞外液LDH和細胞ROS水平（）

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2.3 對比各組單胺類遞質和氨基酸類神經遞質的含量：數據顯示，正常對照組和高、中、低劑量淫羊藿組的谷氨酸、谷氨酸胺、Y-氨基丁酸的含量明顯低于OGD模型組；多巴胺和天冬氨酸的含量明顯高于OGD模型組，差異存有統計學學意義，見表2。

3 討 論

近些年對腦缺血再灌注損傷的研究中可發現，其病理過程受到較多因素的影響，比如說有因為氧化應激而導致的離子平衡呢紊亂、氧自由基損傷、凋亡和炎癥損傷等等[3]。腦組織當中的不飽和脂肪酸的濃度比較高，需要消耗掉比較多的氧氣含量，具有較為敏感的氧化應激損傷，在腦組織缺血和再灌注的過程中均產生有較多的氧自由基。如果機體自身的清除能力不能承受起生成的氧自由基，就會導致發生脂質過氧化反應，多余的脂質過氧化物和自由基會破壞神經細胞膜的結構，從而使得腦組織損傷加重。神經細胞在臨床上的凋亡進展主要有以下幾點：第一是缺血缺氧本身激活了凋亡蛋白因子及有關的細胞因子的產生；第二是大量氧自由基對神經元造成嚴重損傷的同時，也誘導了凋亡的發生；第三是線粒體損傷導致細胞能量代謝障礙，從而在凋亡發生過程中起重要作用；第四是鈣超載激活一系列鈣依賴性酶促反應，促進了凋亡的發生。

在本次研究中運用胚鼠神經細胞進行原代培養，神經細胞氧化損傷模型的制作采用缺氧缺糖和復糖復氧模擬缺血再灌注，采用淫羊藿來干預細胞缺糖缺氧缺血與復糖復氧再灌注，從神經細胞的凋亡機制入手，應用分子生物學技術，研究中藥活性成分淫羊藿苷能否調節神經細胞凋亡，同時探討神經細胞凋亡的發病機制，并探討中醫藥防治神經細胞凋亡的防治效果和作用機制，為臨床防神經缺血性腦病提供理論依據。研究發現，淫羊藿苷可以激活PI3K/Akt信號通路抑制高濃度的糖皮質激素誘導的神經元調亡；抑制tau蛋白的過度磷酸化抑制AP的神經毒性；減少TNF-α、IL-6、COX表達以及減少過氧化物的含量；促進一氧化氮合成酶的表達進而保護血管內皮細胞。淫羊藿苷通過JNK/ p38MAPK信號通路抑制小膠質細胞激活而減少 NO、前列腺素 E2、活性氧自由基（ROS）的釋放，還可以減少 TNF-α、IL-lp、IL-6等的生成，發揮抗炎癥及抗氧化應激作用。

研究結果表明，淫羊藿苷能夠使得神經細胞的存活率得到明顯的升高，并使得神經細胞凋亡減少，進而使得細胞外液中LDH和神經細胞ROS的水平得到顯著的降低。在細胞的凋亡中ROS具有十分關鍵的作用，ROS在受到信號的刺激下會升高其水平，明顯降低線粒體跨膜電位，從而引發線粒體將細胞色素C釋放出來[5]，進而誘導細胞發生凋亡。本次研究中淫羊藿苷能夠使得缺塘缺氧后的細胞存活率得到提高，使得ROS的生成得到有效的減少，由此可說明ROS在淫羊藿苷的神經保護中能夠發揮重要作用。在ROS的生成中人體內會有多種酶的參與，最為主要是是黃嘌呤氧化酶、環氧合酶和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶這三種，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶能夠使得細胞內ROS的水平得到快速的提高，與此同時還可以使得信號向核內轉移得到加快[6]，從而參與到細胞的整個分化凋亡過程中。淫羊藿苷可以使得ROS的生成得到明顯的減少，這也從側面說明淫羊藿苷很有可能是一種新型的抗氧化劑[7]。綜上所述，在神經細胞的缺血再灌注損傷中，采用淫羊藿苷能夠起到保護作用，減少神經細胞中ROS的生成與保護作用有著較大的關聯。