剩余胚胎來源的囊胚凍融移植周期臨床結局分析

鄒敏，李姣，邵淑敏，胡廉，張潔，張玲*

(1.華中科技大學同濟醫學院生殖醫學中心，武漢 430010；2.華中科技大學同濟醫學院計劃生育研究所/生殖醫學中心，武漢 430010)

隨著胚胎體外培養系統的逐漸成熟，囊胚培養在輔助生殖技術中應用日益廣泛。然而全部胚胎行囊胚培養仍存在無囊胚形成的風險，因此不少生殖中心對新鮮周期D3卵裂期胚胎的處理策略為根據胚胎形態學評分將最優質胚胎進行移植和/或冷凍，然后將剩余的胚胎進行囊胚培養，以篩選出更具發育潛能的胚胎，提高胚胎利用率。臨床研究數據已經證明囊胚移植可提高胚胎種植率、臨床妊娠率、活產率以及降低早期流產率[1-2]。那么這些剩余胚胎培養形成的囊胚發育能力又如何呢？本研究回顧性分析2015年1月至2017年12月本中心年齡<36歲的患者凍融移植周期臨床資料，對比分析剩余胚胎來源的D5、D6囊胚及D3優質卵裂期胚胎的種植率、臨床妊娠率、早期流產率，探討剩余胚胎繼續培養所形成的囊胚的發育潛能，同時為凍融移植周期胚胎的選擇提供依據。

資料與方法

一、研究對象

2015年1月至2017年12月在華中科技大學同濟醫學院生殖醫學中心進行凍融胚胎移植的患者。

納入標準：(1)女方年齡<36歲；(2)移植的D3胚胎均為優質胚胎；(3)移植的囊胚符合以下條件：來源于D3移植和/或冷凍了形態學評分最優質胚胎后剩余的正常受精胚胎、D3胚胎卵裂球數≥4，D5或者D6囊胚形成評分≥3CC者。

排除標準：夫妻任何一方染色體異常及女方子宮畸形患者。

共納入993個凍融移植周期，其中172個周期移植D5囊胚、111個周期移植D6囊胚、710個周期移植D3優質卵裂期胚胎。

二、方法

1.胚胎培養：采用商品化的G-seriesTM培養液(Vitrolife，瑞典)對胚胎進行序貫培養，受精卵置于G-1TMPLUS液滴中培養，至D3移植和/或冷凍質量最優質的胚胎后剩余的≥4細胞的所有正常受精胚胎轉至 G-2TMPLUS液滴中培養至D5/D6。

2.胚胎冷凍及復蘇：所有胚胎的冷凍及復蘇嚴格按照玻璃化冷凍及復蘇試劑盒(KITAZATO，日本)說明書操作，僅在平衡時間及洗滌時間稍作改進。囊胚冷凍前需激光打孔皺縮，除此之外囊胚與D3卵裂期胚胎冷凍及復蘇操作步驟均相同。冷凍過程分兩步：胚胎于1#平衡液(ES)中平衡6 min；轉至2#玻璃化冷凍液(VS)中，快速裝桿，該步驟應該在1 min內完成。復蘇過程為4步：胚胎于37℃預溫的1#解凍液(TS)中迅速復溫，該過程在1 min內完成；復溫的胚胎先后置于2#稀釋液(DS)3 min、3#洗滌液(WS)5 min、4#WS 2 min。

3.胚胎評分標準：(1)根據Peter評分系統對卵裂期胚胎進行評分[3]。Ⅰ級：卵裂球大小均勻，形狀規則，透明帶完整，胞質均勻，無顆粒現象，碎片<10%；Ⅱ級：卵裂球大小稍不均勻，形狀稍不規則，胞質有顆粒現象，碎片在10%～20%之間；Ⅲ級：卵裂球不均勻，形狀不規則，胞質有明顯顆粒現象，碎片在20%～50%之間；Ⅳ級：卵裂球嚴重不均勻，形狀嚴重不規則，胞質有嚴重顆粒現象，碎片>50%。D3優質胚胎為卵裂球數目≥6個的Ⅰ、Ⅱ級胚胎。(2)按照Gardner評分系統對囊胚進行評分[4]。先根據囊胚腔的大小和孵出程度將囊胚分成1～6期，然后對其中3～6期囊胚的內細胞團(ICM)和滋養外胚層(TE)按細胞數目及排列進行評分：A級(細胞數目多，排列緊密)、B級(細胞數目較少，排列松散)、C級(細胞數目極少)。期別≥3期且ICM及TE評分均≥B級的囊胚為優質囊胚；期別≥3期且ICM及TE其中任何一類細胞群評分≥B級的囊胚為可利用囊胚；ICM及TE評分均為C的囊胚或者D6形成的期別<3期者為劣質囊胚。

4.內膜準備方法：(1)自然周期：在月經周期第8～10天起B超監測卵泡和內膜發育情況，當卵泡最大直徑≥14 mm監測排卵，LH峰后肌注黃體酮；排卵后3～4 d行卵裂期胚胎移植或排卵后5 d行囊胚移植。(2)人工周期：在月經周期第3天開始使用戊酸雌二醇(Delpharm Lille，法國)，10 d后每隔3～5 d行B超監測內膜厚度，當內膜厚度≥8 mm肌注黃體酮，3～4 d后行卵裂期胚胎移植或5 d后行囊胚移植；(3)降調+人工周期：在月經第2天皮下注射短效GnRH激動劑(Ferring，德國)，28～30 d測量血清E2及LH水平，判斷是否達成降調，B超評估內膜厚度。符合條件者開始人工周期方案。

5.胚胎移植：使用移植管(COOK，美國)及氣密注射器(COOK，美國)一段式裝管后，超聲引導下于子宮腔中后部推出胚胎。

三、觀察指標及判定標準

總結分析患者一般資料、助孕過程指標及臨床結局。

囊胚形成率：形成的囊胚數/用于囊胚培養的D3卵裂期胚胎數×100%；可利用囊胚率：可利用的囊胚數/形成的囊胚數×100%；種植率：B超顯示孕囊個數/移植胚胎個數×100%；臨床妊娠率：B超顯示有孕囊的移植周期數/移植周期數×100%；早期流產率：早期流產周期數/移植周期數×100%，早期流產為B超顯示有孕囊后臨床確認胚胎停育或者異位妊娠者。

四、統計學分析

結 果

一、新鮮周期剩余D3胚胎繼續培養的囊胚形成情況

基于新鮮周期D3移植和/或冷凍最優質胚胎后剩余胚胎行囊胚培養的囊胚培養策略，本中心2015年1月至2017年12月共有6 562枚D3剩余胚胎用于囊胚培養，囊胚形成率為53.75%(3 527/6 562)，可利用率為67.54%(2 382/3 527)。

二、各組患者基本情況比較

根據凍融移植周期中移植胚胎的來源，將患者分為3組：D5囊胚組、D6囊胚組和D3卵裂期胚組。三組間女方年齡、不孕年限、不孕因素、內膜準備方案、子宮內膜厚度及形態等均無統計學差異(P>0.05)(表1)。

表1 三組患者基本情況比較[(-±s)，n(%)]

注：組間相互比較，*P<0.05

三、各組臨床結局比較

D3移植和/或冷凍最優質胚胎后剩余胚胎行囊胚培養形成的囊胚凍融移植周期的總臨床妊娠率為62.54%、種植率為45.51%。

1.三組臨床結局比較：D5囊胚、D6囊胚及D3卵裂期胚三組間復蘇率、平均移植胚胎個數及早期流產率均無統計學差異(P>0.05)；D5囊胚組移植的優質囊胚數顯著高于D6囊胚組(P<0.05)；D5囊胚組臨床妊娠率及種植率顯著高于D6囊胚組和D3卵裂期胚組(P<0.05)；D6囊胚組臨床妊娠率及種植率與D3卵裂期胚組無統計學差異(P>0.05)(表2)。

2.相同質量D5囊胚與D6囊胚移植臨床結局比較：均為優質囊胚時，D5囊胚組臨床妊娠率及胚胎種植率均顯著高于D6囊胚組(P<0.05)；當移植的2枚胚胎其中1枚為優質囊胚另外1枚為非優質可利用囊胚(優質+非優質可利用囊胚)時，D5囊胚組種植率顯著高于D6囊胚組(P<0.05)，而臨床妊娠率無統計學差異(P>0.05)；均為非優質可利用囊胚時，D5囊胚組臨床妊娠率及種植率均高于對應質量的D6囊胚，但無統計學差異(P>0.05)；移植的2枚胚胎中至少包含1枚劣質囊胚的情況，數據較少，未做統計學分析(表3)。

表2 三組凍融胚胎移植臨床妊娠結局比較[(-±s)，n(%)]

注：與D6囊胚組比較，*P<0.05；與其他兩組比較，#P<0.05

表3 相同質量D5囊胚及D6囊胚移植的臨床結局比較[n(%)]

注：與對應質量D6囊胚組比較，*P<0.05

討 論

目前臨床根據D3胚胎形態學評分判斷胚胎的發育潛能，然而實踐顯示形態學指標并不可靠，即使D3非優質胚胎也有可能形成囊胚。囊胚培養是更為可靠的胚胎篩選的手段。Kaartinen等[5]回顧性分析發現，按照標準需要廢棄處理的D3劣質胚胎繼續培養至囊胚后冷凍，復蘇后移植獲得24.6%的臨床妊娠率及17.2%分娩率。王雅琴等[6]的研究顯示D3卵裂球數在3～5個、胚胎碎片在5%～20%的胚胎行囊胚培養，囊胚形成率為33.6%，凍融移植周期臨床妊娠率為40.5%。另有研究顯示發育遲緩的D3胚胎囊胚形成率低于發育速度正常的D3胚胎，但是其形成的囊胚凍融移植周期臨床妊娠率、種植率、孕周數及新生兒體重均與D3發育速度正常的胚胎形成的囊胚無顯著差異[7]。因此對于這部分D3形態學評分較差的胚胎，囊胚培養可篩選出具有發育潛能的胚胎，從而避免胚胎的浪費，提高胚胎利用率。本研究結果證實，包括非優質胚胎及D3移植和/或冷凍形態學評分最優質的胚胎后剩余的次優質胚胎的囊胚形成率為53.75%，且67.54%的囊胚為可利用囊胚，極大地提高了胚胎的利用率。

有研究顯示剩余胚胎培養所形成的囊胚具有極大的發育潛能，凍融周期其臨床結局優于D3優質卵裂期胚胎。Shaw-Jackson等[8]將碎片≥20%、D3發育較慢(<6細胞)、胞漿內出現嚴重的顆粒現象、存在空泡、透明帶異常、D2發育較快(>6細胞)、D2為3個均勻的卵裂球等非優質胚胎進行囊胚培養，發現形成的囊胚在凍融移植周期的臨床妊娠率、種植率均高于D3優質卵裂期胚胎。許麗娟等[9]研究結果也顯示D3優良胚胎冷凍后剩余的非優良胚胎進行囊胚培養，凍融移植周期D5囊胚臨床結局優于D3優良胚胎及D6囊胚。他們用于囊胚培養的非優良胚胎包括細胞數≥4、碎片≤20%的2PN非優良胚胎，D2到D3發育阻滯的胚胎，正常發育的0PN或1PN胚胎。本研究結果與其一致，剩余胚胎形成的囊胚凍融移植周期臨床妊娠率為62.54%、種植率為45.51%。其中D5囊胚臨床妊娠率及種植率明顯高于D3優質卵裂期胚胎和D6囊胚，而D6囊胚臨床妊娠率及種植率與D3優質卵裂期胚胎的臨床結局相當。

剩余胚胎行囊胚培養獲得良好臨床結局的原因可能在于：首先，部分發育潛能較差的卵裂期胚胎因不能形成囊胚而在囊胚培養過程中被淘汰；其次，囊胚的染色體正常率高于D3卵裂期胚胎，研究顯示卵裂期胚胎中大約70%存在染色體異常的可能[10-11]，而囊胚染色體異常率降至約40%[12-13]。D3形態學評分為優質的胚胎也有染色體異常的可能[14]，囊胚培養可以篩除一部分異常胚胎；最后，正常生理狀態下卵裂期胚胎在輸卵管內移動，直到發育至囊胚才進入子宮腔內，因此囊胚移植更符合生理狀態，與子宮內膜的同步性更好。因此D3剩余胚胎行囊胚培養一旦形成可利用囊胚，也可獲得良好的臨床結局。

D5囊胚臨床結局優于D6囊胚，推測原因為囊胚發育速度的影響[15-16]。與D5囊胚相比，D6囊胚發育相對滯后，可能意味著胚胎質量更差或者存在異常的可能性更高[17]。本研究納入的凍融移植周期中D5囊胚組的質量顯著優于D6囊胚組，我們為此進一步對比分析了相同質量的D5囊胚與D6囊胚臨床結局：優質D5囊胚臨床妊娠率及胚胎種植率均明顯高于優質D6囊胚；當移植的2枚胚胎其中1枚為優質囊胚另外1枚為非優質可利用囊胚時，D5囊胚種植率明顯高于D6囊胚，臨床妊娠率則無統計學差異；非優質可利用D5囊胚臨床妊娠率及種植率均高于對應質量的D6囊胚，但無統計學差異。與武龍梅等[18]的研究結果一致，他們的研究顯示優質D5囊胚臨床結局顯著優于D6囊胚。而譚巧等[19]的研究結果則顯示凍融移植周期優質D5囊胚與優質D6囊胚臨床結局無顯著差異，非優質D5囊胚臨床結局優于對應質量的D6囊胚。雖然不同的研究得到的結果不完全一致(可能與研究數據均偏少有關)，但是所有的研究均顯示D5囊胚臨床結局優于D6囊胚，僅僅具體到不同質量時有些質量的D5囊胚臨床妊娠率和/或種植率稍高于D6囊胚而無顯著性差別。

綜上所述，新鮮周期D3移植和/或冷凍后剩余的胚胎繼續培養，可獲得良好的囊胚形成率；所形成的囊胚在凍融移植周期中也可獲得良好的妊娠結局；D5形成的囊胚具有更高的發育潛力，復蘇時可優先選擇，以便患者在最少的移植周期獲得臨床妊娠。