海藻糖酶應用于谷氨酸發酵的研究

叢澤峰，彭超*，張宇，王林，叢琦林，陳美君

(1.中糧生化能源(龍江)有限公司，黑龍江 齊齊哈爾 161100；2.濰坊醫學院，山東 濰坊 261042；3.山東師范大學 生命科學學院，濟南 250014)

在溫敏型谷氨酸發酵生產過程中，需要消耗大量的葡糖糖供菌體生長利用，發酵前期，糖的消耗用于菌體生長；發酵中后期，糖的消耗用于合成谷氨酸[1]。發酵過程中隨著發酵環境的不斷改變，谷氨酸菌體受環境變化影響逐步合成海藻糖[2]；海藻糖由2個葡萄糖分子以1,1-糖苷鍵構成，不含有游離的醛基，不易降解為還原性單糖，可通過海藻糖酶分解[3]。谷氨酸菌體不能消耗利用海藻糖，影響發酵后期代謝物的合成，增加了流加糖的消耗，并對提取工序谷氨酸等電結晶工藝造成一定影響。為了進一步提高谷氨酸發酵的收率及降低味精的生產成本，通過進行谷氨酸發酵工藝優化，在發酵后期27～28 h加入海藻糖酶，將海藻糖轉化成葡萄糖，供谷氨酸菌體二次利用。經過工藝優化，發酵后期添加海藻糖酶后，谷氨酸發酵產酸17.6 g/L，比發酵工藝調整前產酸提高了0.6%左右，發酵糖酸轉化率提高了0.9%左右，溫敏型谷氨酸發酵的綜合水平均有所提高。

1 材料與方法[4-6]

1.1 實驗材料及主要試劑

溫敏型谷氨酸菌種、生產用玉米漿、豆粕水解液、谷氨酸菌體蛋白：均由中糧生化能源(龍江)有限公司提供；谷氨酸菌體蛋白水解液：自制；甜菜糖蜜：北方制糖廠；聚醚消泡劑：濟南易豐化工廠；海藻糖酶：杰能科(中國)生物工程有限公司；其他實驗試劑：均購于天津科密歐有限公司。

1.2 實驗主要儀器及設備

谷氨酸種子罐、谷氨酸發酵罐 國強生化公司；生物傳感儀 山東省科學院生物研究所；pH計 上海雷磁儀器廠；HH-S4型數顯恒溫水浴鍋、722S型分光光度計。

1.3 培養基

種子培養基：葡萄糖25 g/L，生產用玉米漿30 mL/L，尿素 5.0 g/L，酵母浸膏3.0 g/L，磷酸氫二鉀1.7 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，硫酸錳1 mg/L，硫酸亞鐵1 mg/L，維生素B1100 μg/L，維生素H 120 μg/L，pH 7.0，0.1 MPa，滅菌20 min。二級種子培養基：淀粉糖29 g/L，玉米漿20 mL/L，磷酸氫二鉀2.0 g/L，硫酸鎂 0.6 g/L，硫酸錳0.2 mg/L，硫酸亞鐵0.2 mg/L，維生素B1200 μg/L，維生素H 120 μg/L，pH 7.0，滅菌20 min?；A發酵培養基：淀粉水解糖50 g/L，玉米漿20 mL/L，豆粕水解液22 g/L，糖蜜45 g/L，磷酸氫二鉀3 g/L，硫酸鎂1.2 g/L，硫酸錳35 mg/L，硫酸亞鐵20 mg/L，維生素B1300 μg/L，維生素H 400 μg/L，聚醚消泡劑1 mL/L，補料糖濃度為55%，分別采用1，2，3 mg/L，pH 7.0，0.1 MPa，滅菌20 min。

1.4 實驗方法

1.4.1 菌體蛋白水解液

燒杯內裝1.2 kg谷氨酸菌體蛋白，加入1.0 L濃硫酸，恒溫水浴鍋內116 ℃維持15 h，終了取抽濾液。

1.4.2 搖瓶種子培養

試劑瓶內裝有一定量的種子培養基，經滅菌后接入活化菌液，置搖床震蕩培養14 h，經檢驗合格后，置于冰箱內保藏。

1.4.3 種子罐培養

種子罐內裝入一定量的培養液，經滅菌后接入搖瓶種子進行培養，培養16 h左右，經檢驗合格后，置于冰箱內保藏。

1.4.4 發酵罐培養

發酵罐內裝入一定量的發酵培養液，經滅菌后接入種子罐內的種子進行培養，33 ℃，通氣量90 mL/min，200 r/min；OD值為1.0時，溫度提高到38 ℃，轉速提高到800 r/min；殘糖在1%左右時流加糖液。控制pH在7.1左右，發酵培養40 h左右。發酵終了測定谷氨酸含量、總用糖量，核算糖酸轉化率(本文簡稱轉化率)。

1.4.5 分析方法

OD值的測定：將發酵樣品稀釋，用722S分光光度計測定吸光值；pH值的測定：采用pH計測定；還原糖和酸濃度的測定：采用生物傳感分析儀測定。發酵過程中，間隔2 h取一次樣，測定還原糖和酸濃度。

谷氨酸發酵糖酸轉化率的計算[7]：

糖酸轉化率=(酸含量×發酵液體積)/(底糖濃度×發酵初體積+流加糖濃度×流加糖體積)×100%。

1.4.6 實驗方法

在溫敏型谷氨酸發酵過程中根據發酵機理間歇添加不同量的海藻糖酶。通過對比谷氨酸發酵產酸率、轉化率、殘糖及OD值綜合分析發酵結果。實驗方案1：原發酵培養基為對照組；實驗方案2：添加不同量的海藻糖酶進行谷氨酸發酵。

2 實驗結果與分析

2.1 不同發酵周期添加海藻糖酶對發酵產酸的影響

溫敏型谷氨酸發酵過程中由于發酵環境的不斷改變，菌體受pH值、溫度、壓力等環境變化影響不斷代謝積累海藻糖，經過多批次實驗后，選用發酵周期27～28 h時間段添加海藻糖酶可以有效提高發酵產酸，結果見圖1。

圖1 不同發酵周期添加海藻糖酶對產酸的影響Fig.1 The effect of trehalase on the acid yield in different fermentation periods

溫敏型谷氨酸發酵過程中，由于發酵環境的不斷改變，谷氨酸菌體受環境變化影響逐步代謝積累合成海藻糖。發酵后期，谷氨酸菌種活力逐步衰退，產酸能力逐漸減弱，隨著海藻糖的增多，反饋抑制影響發酵產酸水平。通過工藝優化，發酵后期采用添加海藻糖酶有效酶解發酵液中的海藻糖，有利于進一步提高發酵產酸。由圖1可知，在發酵后期，2組發酵產酸接近，27～28 h添加海藻糖酶后，加酶組的發酵產酸明顯高于不加酶組0.6%左右。

2.2 海藻糖酶添加量對發酵產酸的影響

將海藻糖酶采用1，2，3 mg/L 3種添加量分別添加到發酵液中，實驗結果見表1。

表1 添加不同量海藻糖酶發酵產酸結果Table 1 The acid production results by adding different amount of trehalase

溫敏型谷氨酸發酵培養過程中，添加不同量的海藻糖酶對發酵產酸有很大的影響，通過添加不同量的海藻糖酶進行對比，按照1 mg/L的添加量發酵產酸較好，見圖2。

圖2 不同添加量海藻糖酶對產酸響Fig.2 The effect of different additive amount of trehalase on acid production

2.3 添加海藻糖酶對發酵糖酸轉化率的影響

溫敏型谷氨酸發酵后期，通過添加海藻糖酶將谷氨酸發酵代謝過程積累的海藻糖進行酶解合成可被谷氨酸菌利用的單糖，替代了一部分需要流加的水解糖，發酵產酸進一步提高的同時，發酵的糖酸轉化率也隨之提高，見圖3。

圖3 添加海藻糖酶對發酵糖酸轉化率的影響Fig.3 The effect of adding trehalase on the sugar-acid conversion rate

3 結論

本次實驗結果表明：溫敏型谷氨酸菌種在發酵過程中，發酵后期27～28 h添加海藻糖酶，發酵產酸提高0.6%左右，發酵糖酸轉化率可以提高0.9%左右，采用添加海藻糖酶的方法對溫敏型谷氨酸發酵生產起到促進作用。