納豆菌的分離、篩選、鑒定及發酵特性對比研究

王歡,李宏梁，杜磊,尉璐杰

(陜西科技大學 食品與生物工程學院，西安 710021)

納豆是大豆經接種納豆芽孢桿菌發酵而成的具有特殊氣味的豆制品，除富含多種人體易吸收的營養成分之外，同時還含有多種生理活性物質[1]，因此享有“超級健康食品”的美稱。研究證實，經常食用納豆可以增強身體機能，起到良好的保健作用[2]。納豆芽孢桿菌抗逆性極強，具有耐高溫和耐酸的特性，可在微酸環境中生存長達4 h[3]，有研究表明，食用納豆之后，納豆菌在腸道內萌發增殖，分泌各種酶及維生素，進而促進腸道有益菌的增殖，對維持并調節腸道微生態的平衡起著重要作用[4]。大量文獻證明，納豆菌的代謝產物納豆激酶具有多種功能[5-8]，其中，溶栓及抑制血栓形成效果較為突出[9，10]。

目前對納豆的研究開發主要集中于納豆成分分析，納豆及保健品制作，納豆激酶等功能成分提取，而對于不同產地的納豆菌發酵性能對比研究報道比較少，因此，本研究擬從北京燕京、日本順食真、大連美屋的鮮納豆產品中分離篩選出多株蛋白酶活性較高的納豆菌，利用其發酵黃豆，對發酵特性進行對比，以期得到1株蛋白酶活性高且發酵性能較好的生產用菌株。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

燕京納豆：北京燕京中發生物技術有限公司；順食真納豆：北海道小樽市錢函株式會社；御城納豆：大連美屋食品有限公司；枯草芽孢桿菌：實驗室保存；黃豆：山西綠色山區農副產品銷售有限公司。

1.2 儀器與設備

LDZX-40II型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠；THZ-C-1 全溫振蕩器 上海中庸檢驗設備有限公司；BSC-1300II超凈工作臺、SPX-250B-Z生化培養箱 上海博迅實業有限公司醫療設備廠；BK5000生物顯微鏡 重慶奧特光學儀器有限公司；722N可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司。

1.3 培養基

1.3.1 液體種子培養基

蛋白胨1%，酵母粉0.5%，NaCl 1%，瓊脂1.5%，pH 7.0～7.2，121 ℃滅菌15 min。

1.3.2 脫脂牛奶培養基

A脫脂奶粉4% 115 ℃滅菌15 min；B 瓊脂粉4%，121 ℃滅菌15 min；冷卻后混勻倒平板。

1.3.3 明膠培養基

蛋白胨0.5%，明膠12%，pH 7.2～7.4，115 ℃滅菌20 min。

1.3.4 甲基紅培養基

蛋白胨0.5%，葡萄糖0.5%，NaCl 0.5%，pH 7.0～7.2，115 ℃滅菌30 min。

1.3.5 淀粉水解培養基

A 肉汁胨：蛋白胨1%，牛肉膏0.3%，pH 7.1～7.6；B 肉汁胨中加0.2%的可溶性淀粉，121 ℃滅菌20 min。

1.3.6 LB瓊脂培養基

胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，氯化鈉1%，瓊脂粉1.5%，pH 7.2～7.4，121 ℃滅菌15 min。

1.4 實驗方法

1.4.1 菌種分離

采用平板稀釋法進行分離。取3種市售鮮納豆各25 g，分別置于225 mL滅菌生理鹽水中，制得10-1稀釋度的菌懸液，于120 r/min震蕩30 min，80 ℃水浴30 min(目的是殺死雜菌及納豆菌營養體)，然后迅速冷卻至室溫制得芽孢懸液。將芽孢懸液進行梯度稀釋，直至稀釋到10-9，取10-7,10-8,10-9稀釋度的樣品勻液100 μL涂布于LB瓊脂培養基上于37 ℃倒置培養24 h，進行分離培養。

1.4.2 菌株篩選

對于從LB瓊脂培養基上分離出的單菌落進行菌落形態觀察，對符合目標的疑似菌株進行脫脂牛奶平板篩選。

具體篩選過程如下：用滅菌牙簽蘸取少許待測菌株，點植于脫脂牛奶培養基上，于37 ℃恒溫培養箱中倒置培養18 h，測定透明圈及菌落直徑。

在各產地納豆產品中，分別選取水解圈大的菌落作為后續實驗菌株，在脫脂牛奶培養基上連續劃線分離至純，斜面保藏備用。

1.4.3 生理生化鑒定

對篩選出的菌株分別進行革蘭氏鏡檢、甲基紅、淀粉水解、明膠液化、檸檬酸鹽利用試驗，試驗參照《常用細菌系統鑒定手冊》進行。

甲基紅試驗：有的細菌在糖代謝過程中，分解葡萄糖產生丙酮酸，丙酮酸可進一步分解，產生甲酸、乙酸、乳酸等，使培養基pH下降至4.5以下，加入甲基紅試劑則呈紅色。

淀粉水解試驗：有的細菌具有合成淀粉酶的能力，可以分泌胞外淀粉酶，淀粉酶可以使淀粉水解，則淀粉培養基遇碘不再變藍。

明膠液化試驗：有的細菌代謝可產生明膠酶，使半固體的明膠培養基失去凝固力而成為流動的液體。

檸檬酸鹽利用試驗：檸檬酸鹽培養基中，檸檬酸鈉為唯一碳源，磷酸二氫銨為唯一氮源，某些細菌能利用檸檬酸鈉為碳源，分解產生碳酸鹽，使培養基呈堿性，則加入0.04%酚紅指示液后呈桃紅色。

1.4.4 納豆菌生長曲線的測定

將分離菌株在斜面培養基上活化24 h，用接種環挑取1環接種至液體種子培養基(裝液量50 mL/250 mL)中，于37 ℃，200 r/min搖床培養，每隔2 h或4 h取樣，按照濃度適當稀釋后測定OD600值。以培養時間為橫坐標，OD600值為縱坐標，繪制納豆菌的生長曲線，并確定最適種齡。

1.4.4.1 納豆制作過程

取色澤金黃的大豆200 g，按照1∶3(W/V)的比例加入水浸泡過夜，瀝干水分后于高壓滅菌鍋中121 ℃下蒸煮30 min，待溫度降至50 ℃時按照6%的接種量進行接種，于37 ℃條件下發酵24 h后，置于4 ℃冰箱中后熟24 h即可得到納豆成品。

1.4.4.2 納豆發酵特性評定

對發酵納豆的感官指標、拉絲長度、粘液產率、納豆活菌數等指標進行評價。

在本實驗室選擇16名學生(8男8女)組成感官評價小組，分別從納豆的顏色、氣味、口感3個方面進行打分。隨機對樣品進行數字編碼，排列樣品順序，滿分10分，感官評分標準見表1。

表1 納豆感官評分標準Table 1 Sensory evaluation standard of natto

拉絲長度的測定：將后熟的納豆均勻攪拌后，用鑷子將2顆納豆夾起，向兩側拉伸，記下絲斷時的長度即為拉絲長度，每個樣品做3次平行試驗，求平均值。

粘液產率的測定：準確稱取5.000 g的納豆，一式兩份，一份直接在70 ℃烘箱中烘至恒重W1，另一份用蒸餾水洗去納豆表面的粘液，移入烘箱至恒重W2，粘液產率即為(W1-W2)/W1。

納豆活菌數的測定：采用平板計數法，參照GB 4789.2-2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》進行。

2 結果與討論

2.1 菌株分離結果

樣品稀釋液經80 ℃，30 min高溫處理后，涂布于LB瓊脂培養基，于37 ℃培養24 h后結果見圖1。

圖1 納豆菌分離結果圖Fig.1 The result of natto isolation

由圖1可知，在平皿上總共分離出17株菌，并且多以單菌落分布，說明稀釋度比較合適。17株菌菌落直徑較大，呈圓形，且表面粗糙不透明，污白色或微黃色，中心有少量粘液，均符合納豆菌的菌落形態。對17株菌編號為A1～A6，B1～B6，C1～C5。

2.2 菌株篩選結果

主要利用了納豆菌產蛋白酶的特性，將分離得到的17株菌用牙簽點種于脫脂牛奶培養基上，每個平板點4次，37 ℃培養18 h，測定菌落及透明圈直徑，透明圈直徑-菌落直徑表示水解圈大小，其值越大，表示產蛋白酶能力越強。

分離出的17株菌在脫脂牛奶培養基上均產生了透明圈，說明均具有產蛋白酶的能力，其中從產地A中分離的6株菌中，A1產酶能力最強，從產地B中分離出的6株菌中，B2產酶能力最強，從產地C中分離出的5株菌中，C2產酶能力最強，具體結果見圖2。

圖2 17株菌相對蛋白酶活性Fig.2 Relative protease activities of 17 strains

2.3 生理生化鑒定結果

對篩選出的3株高產蛋白酶的納豆疑似菌進行了6項生理生化試驗，即革蘭氏染色鏡檢、甲基紅、淀粉水解、明膠水解、檸檬酸鹽利用試驗，鑒定過程中以枯草芽孢桿菌做對照，結果見表2和圖3。

表2 菌株A1，B2，C2生理生化鑒定結果表Table 2 The physiological and biochemical identification results of strain A1, B2 and C2

圖3 菌株A1，B2，C2生理生化鑒定結果圖Fig.3 The physiological and biochemical identification results of strain A1, B2 and C2

由表2和圖3可知，篩選出的菌株A1，B2，C2其理化性質為：革蘭氏染色、甲基紅試驗、淀粉水解試驗、明膠液化試驗、耐鹽生長試驗和對照組枯草芽孢桿菌一樣呈陽性結果，由此判斷這3株菌均為納豆菌。

2.4 發酵特性對比結果

2.4.1 3株菌的生長曲線

對納豆菌A1，B2，C2進行了生長曲線測定，其結果見圖4。

圖4 納豆菌A1，B2，C2的生長曲線Fig.4 The growth curves of Bacillus natto A1, B2 and C2

由圖4可知，3株菌在液體種子培養基中的生長狀況大體一致，在0～2 h時，菌體濃度增長緩慢，處于環境適應期；2～14 h時，培養基內營養物質豐富，菌體大量繁殖，菌體濃度呈指數上升狀態；14 h之后，菌體濃度變化不大，納豆菌處于生長穩定區。在衰退期內，活菌數量會有所減少，但從圖4中未能明顯看出衰退期開始時間，這是由于菌懸液的濃度與光密度成正比，利用分光光度計測定菌懸液的光密度來反映菌液濃度時，測定的是培養液中的總菌數，包含了活菌與死菌，反映在圖4中則OD600值基本不變。因此，綜合比較，3株菌均選用種齡為14 h的納豆芽孢桿菌進行后續發酵試驗。

2.4.2 3種納豆的指標評價結果

2.4.2.1 感官評價對比

對源于不同產地的納豆菌進行發酵試驗，對成品納豆進行了感官評定。其中納豆菌A1，C2發酵的產品均顏色黃亮，具有納豆特有的醬香味，口感軟硬適中，并且粘液較多，A1的感官平均得分為7分，C2的感官平均得分達8分。納豆菌B2發酵的產品顏色呈褐色，粘液較少，氨臭味較重，平均感官評分僅為4分。

2.4.2.2 3種納豆的粘液產率、拉絲情況對比

3種納豆的拉絲情況及粘液產率見表3。

表3 3種納豆的拉絲情況及粘液產率Table 3 The wire drawing condition and mucus yields of three types of natto

由表3可知，3種納豆的拉絲長度存在差別：其中C2菌發酵的納豆拉絲長度最好，為14.8 cm；其次為A1菌發酵的納豆，拉絲長度為9.83 cm，B2相對較短，拉絲長度僅為6.77 cm。粘液產率印證了拉絲長度，粘液產率值越高，則拉絲情況越好。

2.4.2.3 納豆活菌數分析

本實驗對接種前的種子液及發酵好的成品納豆分別進行了活菌數測定。其中納豆菌A1種子液中活菌數為1.1×109cfu/mL，發酵的成品納豆中活菌數為2.21×109cfu/g，活菌數增長了32.48倍。納豆菌B2種子液中活菌數為2.4×109cfu/mL，發酵的成品納豆中活菌數為4.14×109cfu/g，活菌數僅增長了27.75倍，納豆菌C2種子液中活菌數為5.4×108cfu/mL，發酵的成品納豆中活菌數為3.78×109cfu/g，活菌數增長達115.67倍。盡管這3株納豆菌在液體種子培養液中增殖狀況大致相同，但從以上數據來看，當以大豆作為培養基質時，生長狀況還是存在較大差異。

菌株B2發酵的納豆中雖然活菌數最高，但從增長倍數分析來看，納豆菌B2的增殖能力明顯弱于其他2株菌，納豆菌C2的增殖能力最強，A1次之。而納豆表面的粘液物質是納豆菌在生長增殖過程中的代謝產物，這也可能是C2納豆粘液產率及拉絲長度高于其他2株菌發酵物的原因。

3 結論

本研究根據待分離菌株的耐熱性以及水解酪蛋白的特點，從北京燕京、日本順食真、大連美屋納豆中各分離、篩選出1株纖溶活性較高的菌株A1，B2，C2后，以枯草芽孢桿菌為對照，對這3株菌進行了生理生化驗證試驗，結果判定A1，B2，C2均為納豆菌。其中，納豆菌C2在發酵納豆過程中，活菌數增殖最快，粘液產率為5.93%，拉絲長度最長且感官評價較高；納豆菌B2在發酵過程中活菌數增殖最慢，盡管發酵的納豆中活菌數最高，但粘液產率及拉絲長度均不理想，發酵的產品顏色呈紅褐色，整體評價偏低，納豆菌A1在發酵過程中，活菌數增加了32.48倍，粘液產率為4.10%。因此，分離的納豆菌C2有待于進一步開發利用。