磺胺甲噁唑與吉富羅非魚血漿蛋白結(jié)合率的測定方法研究

王賽賽，宋 懌，程 波

(1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100141)

藥物-血漿蛋白結(jié)合率是一個重要的藥代動力學(xué)參數(shù)。大部分藥物經(jīng)吸收進(jìn)入血液循環(huán)后，會不同程度地與血漿蛋白結(jié)合而喪失藥理活性，只有游離的藥物才能自由透過細(xì)胞膜最終到達(dá)作用部位[1]。藥物血漿蛋白結(jié)合率通過制約游離藥物濃度，來影響藥物在動物體內(nèi)的分布、代謝和消除規(guī)律[2,3]。因此，藥物-血漿蛋白結(jié)合率的測定無論是對于藥物代謝動力學(xué)、藥效學(xué)還是藥物殘留預(yù)測模型的構(gòu)建均具有重要意義。目前測定藥物-血漿蛋白結(jié)合率最常用的方法為體外平衡透析法和體內(nèi)超濾法，在以往的研究中，體外平衡透析法涉及的因素主要為平衡時間[4-5]、血漿含量[4]、透析溫度[1,4-5]和藥物濃度[4-5]，透析時間的確定試驗(yàn)大多以空白透析液取代空白血漿為主，忽略了實(shí)際試驗(yàn)中結(jié)合率達(dá)到穩(wěn)定的時間；不同藥物血漿蛋白結(jié)合率受溫度的影響存在差異；不同藥物濃度對結(jié)合率的影響也因藥物與物種的差異而有所不同。體內(nèi)超濾法[6]大多采用解凍后的血漿進(jìn)行超濾，忽略了血漿儲存過程中pH的改變以及其對結(jié)合率造成的影響[7,8]。因此，本研究在前人的基礎(chǔ)上，將平衡時間、溫度、pH、藥物濃度列入結(jié)合率測定的影響因素，以磺胺甲噁唑(SMZ)為研究對象，通過采用體外平衡透析法，研究不同溫度(4、25、37 ℃)、不同pH(7.4、7.8、8.2)對結(jié)合率的影響，來確定體外平衡透析法和體內(nèi)超濾法的最佳測定條件，從而得出不同藥物濃度下體內(nèi)外SMZ羅非魚血漿蛋白結(jié)合率。最后，通過對體內(nèi)外測定結(jié)果進(jìn)行對比分析，確定SMZ血漿蛋白結(jié)合率的最佳測定方法，為SMZ藥物代謝理論研究和藥物殘留預(yù)測模型的構(gòu)建提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

SMZ標(biāo)準(zhǔn)品(≥99.0%)，氘代磺胺鄰二甲氧嘧啶(99.8%±0.2%)購于德國Dr.Ehrenstorfer公司；SMZ(≥99.0%)購于艾覽(上海)化工科技有限公司；肝素鈉(H8060，≥99.0%)，購于北京索萊寶科技有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉、碳酸氫鈉、高氯酸均為分析純，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇、乙腈購于飛世爾實(shí)驗(yàn)器材(上海)有限公司；甲酸購于上海安譜科學(xué)儀器有限公司；醋酸銨購于美國Fluka公司；超純水由MilliQ純水系統(tǒng)制備而成。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀、TQU03530型質(zhì)譜儀，均購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；HCB 1002型電子天平，購自艾德姆衡器(武漢)有限公司；H-2050R型離心機(jī)、H/T16MM型離心機(jī)均購自湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室開發(fā)有限公司；MIR-154-PC恒溫培養(yǎng)箱，購自日本三洋電機(jī)公司；N-EVAP1/2型氮吹儀，購自美國Organomation公司；MS3bsic型渦旋振蕩器，購自IKA公司；SB-5200DTN型超聲波清洗儀，購自新芝有限公司；美國MilliQ純水系統(tǒng)；透析袋MD-10(8-14 kD)購自北京索萊寶科技有限公司；超濾管(Millipore，10 kD)購自北京蘭博利德商貿(mào)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物

健康的羅非魚購買于北京市岳各莊批發(fā)市場，體重為(650±50)g，暫養(yǎng)于消毒后的水箱中，使用加熱棒將水溫控制在(22±2)℃，自然光照，24 h不間斷充氣；每天更換1/3水，投餌并及時清除殘餌和排泄物，暫養(yǎng)1周后，80尾用于取空白血漿及空白超濾液，從而進(jìn)行體外藥物-血漿蛋白結(jié)合率的測定，20尾用于體內(nèi)藥物-血漿蛋白結(jié)合率的測定。采取尾靜脈取血方式，離心管(加入50 μL)和注射器用1%的肝素鈉溶液潤洗，全血于4 ℃、4 000 r/min下離心5 min，分離后的空白血漿合并，均勻混合后，用10 mL離心管分裝，置4 ℃保存?zhèn)溆茫舨荒芗皶r處理，需轉(zhuǎn)至-20 ℃保存。

1.4 體外平衡透析法-測定藥物血漿蛋白結(jié)合率

采用體外平衡透析法測定血漿蛋白結(jié)合率，首先將透析袋(約12 cm)進(jìn)行預(yù)處理[9]，使用前用蒸餾水將透析袋里外沖洗干凈。用棉線扎緊透析袋的一端使不漏液，用移液槍取1 mL空白血漿于透析袋內(nèi)，并將透析袋置于盛有10 mL含藥透析液的15 mL離心管中，用棉線和透析袋上端調(diào)節(jié)透析袋，使袋內(nèi)液面稍低于袋外液面(液面高度差為(0.5±0.1)cm)，注意透析袋不能緊貼管壁，以免影響透析效果。透析達(dá)到平衡后，吸出1 mL透析外液，加等量的高氯酸溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%)，渦旋，檢查有無白色絮狀物析出。若透析外液顯陽性，說明有蛋白漏出，則該樣本作廢。若顯陰性，則取出透析袋，分別取透析內(nèi)外液，分別測定透析內(nèi)液藥物濃度(總濃度Ct)和透析外液藥物濃度(游離濃度Cf)，計(jì)算藥物血漿蛋白結(jié)合率Fb=(Ct-Cf)/Ct×100%。

1.4.1 平衡透析時間的確定

向透析袋內(nèi)加入1 mL空白透析液(0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液)，將透析袋置于10 mL含藥濃度為 30 μg/mL的磷酸鹽緩沖液中，分別透析4、8、12、24、36、48、60 h，每組做5個平行。透析結(jié)束后，分別取透析內(nèi)液與透析外液進(jìn)行檢測，考察因素為透析內(nèi)外液中藥物濃度的比值，若比值接近于1并保持穩(wěn)定，則透析達(dá)到平衡。

將上述空白透析液改為空白血漿，其他操作同上。透析結(jié)束后，分別取透析內(nèi)液(血漿)與透析外液進(jìn)行檢測，考察因素為結(jié)合率，若結(jié)合率趨于穩(wěn)定，則透析達(dá)到平衡。

1.4.2 透析袋對藥物的吸附作用

在透析袋中加入空白透析液1 mL(設(shè)體積為V1)，將透析袋置于10 mL (V2) SMZ質(zhì)量濃度為10、30、60 μg/mL(C1)的透析液中，于4 ℃恒溫培養(yǎng)箱中透析48 h，每組5個平行，測定透析外液的藥物濃度(C2)，計(jì)算透析袋吸附率X。

1.4.3 溫度對結(jié)合率的影響

向透析袋內(nèi)加入1 mL空白血漿，并將透析袋置于10 mL含藥濃度為10、30和60 μg/mL的磷酸鹽緩沖液，分別置于4、25、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中透析，每組5個平行，達(dá)到平衡后，分別取透析內(nèi)外液進(jìn)行檢測。

1.4.4 pH對結(jié)合率的影響

向透析袋內(nèi)加入1 mL空白血漿，將透析袋置于10 mL含藥濃度為10、30和60 μg/mL，pH分別為7.4、7.8、8.2的磷酸鹽緩沖液(用1 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH)，每組5個平行，達(dá)到平衡后，分別取透析內(nèi)外液進(jìn)行檢測。

1.4.5 藥物濃度對結(jié)合率的影響

向透析袋內(nèi)加入1 mL空白血漿，將透析袋置于10 mL含藥濃度為0.5、1、5、10、30和60 μg/mL的磷酸鹽緩沖液中進(jìn)行透析，每組5個平行。透析結(jié)束后，分別取透析內(nèi)外液進(jìn)行檢測。

1.5 體內(nèi)超濾法-測定血漿蛋白結(jié)合率

混飼藥物(濃度為150 mg/mL)的配制：6.06 g磺胺甲噁唑原料藥與6 g飼料(已過篩)混合，加水定容至40 mL。按200 mg/kg魚體重用1 mL注射器和3 cm輸液管對羅非魚進(jìn)行單次口灌給藥，出現(xiàn)回吐現(xiàn)象的舍棄。給藥后用1 mL的注射器分別于0.5、1、2、4 h進(jìn)行尾部靜脈取血，每個時間點(diǎn)三個平行，每條魚取4 mL血，分四次置于含有50 μL 1%肝素鈉的2 mL離心管中，于4 ℃、4 000 r/min下離心5 min，4次分離的血漿合并置于5 mL離心管中，混勻后取0.5 mL血漿(總藥物濃度Ct)于預(yù)處理過的超濾管(加入0.5 mL超純水置于4 ℃冰箱中保存，使用前，于14 000 g下離心15 min)，于4 ℃、14 000 g下離心30 min，收集超濾液(游離藥物濃度Cf)于2 mL離心管中，血漿與超濾液置于-20 ℃下保存，待測。結(jié)合率Fb=(Ct-Cf)/Ct×100%。

按上述方法收集空白超濾液，分別向5 mL的空白超濾液中加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)工作液，使其濃度分別為10、30和60 μg/mL(C0)，按上述方法進(jìn)行超濾離心，收集超濾液(藥物濃度為Ct)，測定膜吸附率Y。

Y=(C0-Ct)/C0×100%

1.6 樣品前處理

含藥血漿：取血漿0.2 mL，加入濃度為1 μg/mL的內(nèi)標(biāo)氘代磺胺鄰二甲氧嘧啶50 μL，渦旋，加入5 mL酸化乙腈(含1%甲酸)，渦旋混勻1 min，超聲提取10 min，加1.0 g無水硫酸鈉，渦旋混勻1 min，4 000 r/min離心5 min，取上清液于10 mL離心管中，殘?jiān)? mL酸化乙腈重復(fù)上述步驟再次提取，合并提取液，于40 ℃下氮吹至干，用1 mL 20%甲醇溶液復(fù)溶，加入2 mL正己烷除脂，過0.22 μm濾膜，供液相色譜-質(zhì)譜檢測[10]。

透析外液和超濾液：取透析外液(超濾液)0.5 mL，加入濃度為1 μg/mL的內(nèi)標(biāo)液50 μL，渦旋混勻，加入5 mL乙酸乙酯，渦旋混勻1 min，4 000 r/min離心5 min，取有機(jī)相于另一支10 mL離心管中，加入3 mL乙酸乙酯重復(fù)上述步驟，合并有機(jī)相，于40 ℃下氮吹至干，1 mL 20%的甲醇溶液復(fù)溶，過0.22 μm濾膜，供液相色譜-質(zhì)譜檢測[10]。

1.7 數(shù)據(jù)處理及分析

采用EXCEL進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用SPSS 20進(jìn)行最小顯著性差異檢驗(yàn)(P>0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法確證

用甲醇溶液對SMZ儲備液(1 000 μg/mL，甲醇溶解)進(jìn)行稀釋，制備0.01、0.1、1、10、100 μg/mL等5個濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。由此制得標(biāo)曲：0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 μg/mL的SMZ溶液(含內(nèi)標(biāo)：0.05 μg/mL)，以SMZ峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值(y)對藥物濃度(x)作線性回歸，得SMZ在0.05～5 μg/mL的范圍內(nèi)，線性方程為y=2.852 8x+0.462 1，r2=0.995 8，樣品(血漿、緩沖液和超濾液)中SMZ的最低檢出限(S/N≥3)為0.002 μg/mL。低、中、高濃度(0.05、0.5、5.0 μg/mL)SMZ在血漿、緩沖液和超濾液中的絕對回收率均在82%～112%之間，說明本方法具有較高的可靠性。日內(nèi)精密度(n=5)均低于11.2%、9.94%和11.79，日間精密度(n=5)均低于13.9%、8.13%和11.0%。

2.2 膜對藥物的吸附作用

透析袋與超濾膜對SMZ的吸附作用見表1。高中低三種濃度條件下，透析袋(超濾膜)對SMZ的吸附率不超過3.8%(8.6%)。表明試驗(yàn)中使用的透析袋(超濾膜)對SMZ僅起到微量吸附作用，對結(jié)合率的測定影響不顯著。因此，可采用該透析袋和超濾膜進(jìn)行SMZ血漿蛋白結(jié)合率的測定。

表1 膜對SMZ的吸附作用Tab.1 The adsorbtion of SMZ for dialysis tubing

2.3 體外平衡透析法測定SMZ血漿蛋白結(jié)合率

2.3.1 穩(wěn)定性

三種(10、30、60 μg/mL)含藥濃度的血漿、透析液在37 ℃避光條件下放置72 h，分別于0、12、24、36、48、60、72 h取樣檢測，結(jié)果見圖1、2。低中高三種含藥濃度的血漿樣品在0～48 h內(nèi)，SMZ的濃度較為穩(wěn)定，RSD值分別為6.68%、5.99%和3.85%，均低于15%。60、72 h內(nèi)，RSD值均高于15%。低中高三種含藥濃度的磷酸鹽緩沖液在0～72 h內(nèi)，SMZ的濃度較為穩(wěn)定，RSD值分別為2.64%、6.24%和4.27%，均低于15%。以上結(jié)果表明，SMZ在37 ℃避光條件下48 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.2 透析時間的確定

透析內(nèi)液為空白透析液時，考察結(jié)果如圖3所示，透析內(nèi)外液藥物濃度比值于8 h后達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，比值維持在1左右。透析內(nèi)液為空白血漿時，考察結(jié)果如圖4所示，藥物血漿蛋白結(jié)合率于24 h后達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，維持在13.26%～14.24%。綜合圖1～4分析結(jié)果，確定平衡透析時間為48 h。

圖1 血漿中SMZ的穩(wěn)定性Fig.1 Stability of SMZ in plasma

圖2 磷酸鹽緩沖液中SMZ的穩(wěn)定性Fig.2 Stability of SMZ in phosphate buffer

圖3 平衡透析時間-透析液Fig.3 Equilibrum dialysis time-dialysate

2.3.3 溫度對結(jié)合率的影響

溫度對結(jié)合率的影響結(jié)果見圖5，相同藥物濃度下，不同溫度對藥物血漿蛋白結(jié)合率的影響不顯著。在同一溫度下，不同的藥物濃度對血漿蛋白結(jié)合率的影響差異不顯著。其中，藥物濃度30 μg/mL時，各溫度下的結(jié)合率平均值分別(14.89±0.75)%、(15.71±2.04)%、(13.94±2.7)%。

圖4 平衡透析時間-血漿Fig.4 Equilibrum dialysis time-plasma

圖5 不同溫度下磺胺甲噁唑與羅非魚血漿蛋白的結(jié)合率Fig.5 Binding rates of SMZ to plasma protein at different temperature

2.3.4 pH對結(jié)合率的影響

4 ℃條件下，不同pH對血漿蛋白結(jié)合率的影響結(jié)果見圖6，相同藥物濃度下，不同pH對血漿蛋白結(jié)合率的影響較為顯著，其中低濃度下影響最為顯著。在同一pH條件下，不同的藥物濃度對血漿蛋白結(jié)合率的影響差異不顯著。其中，藥物濃度為30 μg/mL時，各pH條件下的結(jié)合率平均值分別(15.50±2.55)%、(13.66±0.73)%、(10.91±1.49)%。

2.3.5 藥物濃度對藥物-血漿蛋白結(jié)合率的影響

4 ℃條件下SMZ血漿蛋白結(jié)合率隨藥物濃度的變化結(jié)果見圖7，在透析外液藥物濃度為0.5～60.0 μg/mL時，SMZ血漿蛋白結(jié)合率為14.65%～25.12%，其中，在0.5～10 μg/mL時，藥物血漿蛋白結(jié)合率隨藥物濃度的升高而依次遞減，表明在該范圍內(nèi)，血漿蛋白結(jié)合率具有濃度依賴性；在10～60 μg/mL時，藥物血漿蛋白結(jié)合率趨于平衡，維持在14.65%～15.48%。

不同柱上字母表示不同pH組間差異顯著(P<0.05).

圖7 不同藥物濃度下SMZ的血漿蛋白結(jié)合率Fig.7 Plasma protein binding rates of SMZ in different concentration in dialysate

2.4 體內(nèi)超濾法SMZ血漿蛋白結(jié)合率

灌藥結(jié)束后，羅非魚血漿中SMZ濃度及SMZ血漿蛋白結(jié)合率隨時間的變化結(jié)果見表2。為更加清晰地描述結(jié)合率隨藥物濃度的變化規(guī)律，特將12條魚血漿中SMZ的濃度進(jìn)行排序，以濃度為橫坐標(biāo)、結(jié)合率為縱坐標(biāo)作圖，詳見圖8。由圖8可知，在血漿含藥濃度為1～5 μg/mL時，SMZ血漿蛋白結(jié)合率為15.34%～20.1%，結(jié)合率隨藥物濃度的升高而減小；在10～20 μg/mL時，結(jié)合率趨于穩(wěn)定，維持在12.7%～14.9%。

表2 SMZ血漿蛋白結(jié)合率在羅非魚體內(nèi)的變化Tab.2 The changes of protein binding rates in O.niloticus

圖8 不同藥物濃度下SMZ的血漿蛋白結(jié)合率Fig.8 Protein binding rates of SMZ in different concentration in plasma

3 討論

3.1 溫度對SMZ血漿蛋白結(jié)合率的影響

關(guān)于溫度對血漿蛋白結(jié)合率影響的研究已有很多，章海鑫等[4]和趙鳳等[5]研究發(fā)現(xiàn)雙氟沙星、喹烯酮分別與異育銀鯽、草魚血漿蛋白結(jié)合率不同溫度條件(4～37 ℃)下變化差異不顯著；Lee等[11]、Trnavská等[12]、Dorn等[13]發(fā)現(xiàn)，達(dá)托霉素、吡羅昔康、替加環(huán)素與人血漿蛋白的結(jié)合率不受溫度(5、22、25、37 ℃)的影響。本實(shí)驗(yàn)中，SMZ與吉富羅非魚血漿蛋白結(jié)合率在4、25、37 ℃條件下差異不顯著，該試驗(yàn)結(jié)果與章海鑫等[4]、趙鳳等[5]、Lee等[11]的結(jié)果一致，然而與肖超[1]、Munsey等[14]的研究結(jié)果剛好相反。肖超等[1]通過體外模擬試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，平衡溫度從4 ℃上升到37 ℃，磺胺二甲基嘧啶與家兔血漿蛋白結(jié)合率下降近了20%；Munsey等[14]同樣發(fā)現(xiàn)，平衡溫度從4 ℃上升到45 ℃，磺胺二甲基嘧啶與豬血漿蛋白的親和力降低86%。綜合上述比較研究，可推測出溫度對藥物血漿蛋白結(jié)合率的影響主要與藥物的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)以及藥物與血漿蛋白的親和力有關(guān)。

3.2 pH對SMZ血漿蛋白結(jié)合率的影響

血漿中的結(jié)合蛋白以白蛋白和α1-酸性糖蛋白為主，與α1-酸性糖蛋白不同，白蛋白的結(jié)構(gòu)具有pH依賴性，中性藥物(pH 5～7)和堿性藥物(pH>8)與白蛋白的結(jié)合位點(diǎn)至少有6個，其中結(jié)合位點(diǎn)Ⅰ和結(jié)合位點(diǎn)Ⅱ結(jié)合量最多[3,15-16]，有研究表明，藥物與白蛋白結(jié)合位點(diǎn)Ⅰ的結(jié)合具有pH依賴性[17]，Munsey等[14]和操繼躍等[8]的研究驗(yàn)證了這一觀點(diǎn)。Munsey等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在37 ℃下，pH由6.0調(diào)至8.0，磺胺二甲基嘧啶與豬血漿蛋白的親和力可增強(qiáng)10倍。與之相反的是，操繼躍等[8]研究發(fā)現(xiàn)，在pH為6.8、7.4、7.8條件下，磺胺甲氧嘧啶和磺胺二甲基嘧啶與黃牛血漿蛋白結(jié)合的程度隨pH的增大而減小，在低濃度時這一變化最為明顯，這可能源于不同物種間血漿蛋白結(jié)構(gòu)的特異性[18]。SMZ是一種酸性藥物[19]，易與白蛋白結(jié)合。本實(shí)驗(yàn)中，SMZ與吉富羅非魚血漿蛋白結(jié)合率在不同pH(7.4、7.8、8.2)條件下為差異顯著，SMZ血漿蛋白結(jié)合率隨pH的增大而減小，其中低濃度時尤為顯著，這與操繼躍等[8]的研究相一致。因含藥血漿經(jīng)長期冷凍貯藏后，血漿的pH將會因過程中CO2的損失由7.4上升為7.8甚至到8.0[7]。為了防止因儲存期間pH的改變而影響超濾法測定結(jié)果，建議取血后直接進(jìn)行超濾離心。

3.3 藥物濃度與結(jié)合率的關(guān)系

藥物與血漿蛋白的結(jié)合具有濃度依賴和飽和結(jié)合的特點(diǎn)，這些特點(diǎn)主要與藥物的理化性質(zhì)及血漿蛋白的結(jié)合性質(zhì)有關(guān)[1,20]。余建鑫等[20]、陳培榮等[21]分別在各自的研究中發(fā)現(xiàn)血啉甲醚小鼠血漿蛋白結(jié)合率和河豚毒素血漿蛋白結(jié)合率在一定的藥物濃度范圍內(nèi)隨藥物濃度的升高而降低；Matsumoto[22,23]、肖超等[1]研究發(fā)現(xiàn)在一定濃度范圍內(nèi)，河豚毒素、磺胺二甲基嘧啶及其乙酰化代謝產(chǎn)物的濃度對血漿蛋白結(jié)合率無影響。實(shí)驗(yàn)中，體外平衡透析法和體內(nèi)超濾法的測定結(jié)果(詳見圖7、8)均綜合以上兩種結(jié)果，在低濃度(0.5～10.0 μg SMZ/mL透析液或1～5 μg SMZ/mL血漿)范圍內(nèi)，結(jié)合率隨藥物濃度的升高而減小；在高濃度(10.0～60.0 μg SMZ/mL透析液或10～20 SMZ/mL血漿)范圍內(nèi)，結(jié)合率保持不變。由此可知，SMZ與羅非魚血漿蛋白結(jié)合率與藥物的濃度有關(guān)，從而推斷出SMZ是一種濃度依賴性藥物。

3.4 體外平衡透析法與體內(nèi)超濾法的比較研究

目前已有大量學(xué)者對體外平衡透析法和體內(nèi)超濾法進(jìn)行了對比研究[24,25]，體外平衡透析法操作方便，條件易于控制，結(jié)果可靠，然而該方法耗時長，需要模擬體內(nèi)環(huán)境，透析過程中透析內(nèi)外液體積易發(fā)生變化，易產(chǎn)生Gibbs-Donnan效應(yīng)；體內(nèi)超濾法周期短，可進(jìn)行實(shí)時監(jiān)測，然而含藥血漿儲存期間pH易發(fā)生變化，在超濾期間蛋白質(zhì)逸漏現(xiàn)象頻發(fā)。針對兩種方法存在的一些缺點(diǎn)，有關(guān)學(xué)者作了相應(yīng)改進(jìn)，平衡透析液選擇高強(qiáng)度的濃度為0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液[26](內(nèi)含0.15 mol/L NaCl)，可維持透析期間pH恒定不變、以防血漿稀釋；體內(nèi)超濾法選擇新鮮血漿，或預(yù)先向1 mL解凍血漿加入10 μL 2 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.45)[13]，使血漿的pH維持在正常生理范圍[27]內(nèi)；為了防止超濾離心期間，結(jié)合率因溫度而發(fā)生改變，離心溫度通常設(shè)為4 ℃；在不同離心力和離心時間的研究中發(fā)現(xiàn)，在4 ℃、14 000g下離心30 min，超濾液經(jīng)高氯酸檢測，無蛋白逸出，規(guī)避了蛋白逸漏的缺點(diǎn)。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行平衡透析法與體內(nèi)超濾法的比較研究，獲得一致的結(jié)論：磺胺甲噁唑與血漿蛋白的結(jié)合具有濃度依賴性。然而，不同的是：在1～20 μg SMZ/mL血漿濃度范圍內(nèi)，結(jié)合率達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)時，平衡透析法與體內(nèi)超濾法的測定結(jié)果分別為(15.48±1.49)%、(14.07±0.76)%，體內(nèi)超濾法測定結(jié)果低于體外平衡透析法，這可能與超濾離心造成的濾液濃縮和體內(nèi)磺胺甲噁唑代謝物競爭性結(jié)合血漿蛋白有關(guān)；另外，在實(shí)驗(yàn)期間發(fā)現(xiàn)，與上次試驗(yàn)間隔兩周后重復(fù)測定SMZ血漿蛋白結(jié)合率，體外平衡透析法測定結(jié)果重現(xiàn)性較差(RSD>15%)，體內(nèi)超濾法測定結(jié)果較為穩(wěn)定(RSD<15%)，因此，優(yōu)先推薦體內(nèi)超濾法作為測定SMZ血漿蛋白結(jié)合率的最佳選擇。

4 結(jié)語

本研究采用體外平衡透析法研究了溫度、pH對SMZ羅非魚血漿蛋白結(jié)合率的影響，結(jié)果表明結(jié)合率不受溫度影響，但具有pH依賴性，由此確定體外平衡透析法的測定條件：空白血漿于4 ℃條件下在含藥透析液(內(nèi)含0.15 mol/L NaCl 、pH為7.4、濃度為0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液)中透析48 h；并推斷出體內(nèi)超濾法的最佳測定條件：口灌給藥后，采用新鮮血漿于4 ℃條件下進(jìn)行超濾。在最佳測定條件下，采用以上兩種方法測定體內(nèi)外SMZ血漿蛋白結(jié)合率，測定結(jié)果分別為14.65%～25.12%(體外平衡透析法)和12.7%～20.1%(體內(nèi)超濾法)。兩種方法測定結(jié)果一致表明，在1～20 μg SMZ/mL血漿濃度范圍內(nèi)，結(jié)合率隨血漿中SMZ濃度的升高先減小而后保持穩(wěn)定，即 SMZ血漿蛋白結(jié)合率具有濃度依賴性。通過對兩種方法進(jìn)行比較研究發(fā)現(xiàn)，在高濃度血藥范圍(≥10 μg SMZ/mL)內(nèi)，結(jié)合率達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)時，體內(nèi)超濾法測定結(jié)果低于體外平衡透析法，又因體外平衡透析法重現(xiàn)性較差，故推薦使用體內(nèi)超濾法進(jìn)行磺胺甲噁唑羅非魚血漿蛋白結(jié)合率的測定，該方法周期短、重現(xiàn)性好，可作為體內(nèi)藥物血漿蛋白結(jié)合率測定的最佳選擇。