中心組合設(shè)計—響應(yīng)面法優(yōu)化復(fù)方當(dāng)歸補血湯提取工藝

馬肖 金永新 陳煜娟

摘要：目的 優(yōu)化復(fù)方當(dāng)歸補血湯的提取工藝。方法 在單因素試驗、析因設(shè)計、最速上升試驗的基礎(chǔ)上，以浸膏得率及阿魏酸、芍藥苷、藁本內(nèi)酯提取率的權(quán)重和為響應(yīng)值，采用中心組合設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化復(fù)方當(dāng)歸補血湯的提取工藝。結(jié)果 最佳條件為超聲提取60 min，提取溶劑為36%乙醇，料液比為1∶94。結(jié)論 該方法提取效率較高，操作簡便，預(yù)測性良好。

關(guān)鍵詞：復(fù)方當(dāng)歸補血湯；析因設(shè)計；中心復(fù)合設(shè)計-響應(yīng)面法；提取工藝

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.09.016

中圖分類號：R283.5 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）09-0066-05

Abstract： Objective To optimize extraction technology of Compound Danggui Buxue Decoction. Methods On the basis of single factor test， factorial design， and fastest rise test， yield and weight sum of extraction efficiency of ferulic acid， paeoniflorin and ligustilide were set as response， and central composite design-response surface method was used to optimize the extraction technology of Danggui Buxue Decoction. Results The optimum conditions consisted of ultrasonic-wave extraction for 60 min， ethyl alcohol concentration 36% and the ratio of material to solvent = 1：94. Conclusion This method has high extraction efficiency， easy operation and good predictability.

Keywords： Compound Danggui Buxue Decoction； factorial design； central composite design-response surface method； extraction technology

當(dāng)歸補血湯出自李東垣《內(nèi)外傷辨惑論》，由黃芪、當(dāng)歸按5∶1比例組成，具有補氣生血功效。方中黃芪為君藥，大補脾肺之氣，以資生血之源，配以當(dāng)歸益血和營，兩藥相伍，陽生陰長，氣旺血生，主治勞倦內(nèi)傷、氣弱血虛、陽浮外越，婦人經(jīng)行、產(chǎn)后血虛發(fā)熱頭痛，以及瘡痍潰后久不愈合等。在臨床中，將中藥復(fù)方隨癥加減，可加強、削弱或改變原方的作用，以適應(yīng)不同病情的需要[1-4]。甘肅省第二人民醫(yī)院中醫(yī)科吳華主任醫(yī)師根據(jù)多年臨床經(jīng)驗，將當(dāng)歸補血湯與桃紅四物湯合方加減，組成復(fù)方當(dāng)歸補血湯，在益氣生血基礎(chǔ)上兼能行血通瘀，因其良好的效果而在臨床得到廣泛使用。現(xiàn)擬將復(fù)方當(dāng)歸補血湯開發(fā)成為院內(nèi)制劑，優(yōu)化提取方法對該方的開發(fā)利用具有重要意義。當(dāng)歸、桃仁及川芎在復(fù)方當(dāng)歸補血湯中劑量較大，且對全方功效起主導(dǎo)作用。因此，本試驗選擇當(dāng)歸、川芎共有的有效成分阿魏酸、藁本內(nèi)酯[5]，以及白芍的質(zhì)量控制指標(biāo)芍藥苷，作為優(yōu)化考察指標(biāo)[6]，以其提取率與全方藥物浸膏得率的權(quán)重和為評價指標(biāo)，采用基于單因素試驗、析因設(shè)計試驗及最速上升試驗的中心組合設(shè)計-響應(yīng)面法，對復(fù)方當(dāng)歸補血湯的提取工藝進行優(yōu)化，為該方的深度開發(fā)及綜合利用奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

美國Agilent 1100 LC/DAD系統(tǒng)，Thermo ODS HYPERSIL C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 ?m），KH-500DE數(shù)控超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司），BT125D電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司），HH-S28s數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市大地自動化儀器廠）。

阿魏酸對照品（批號0829-9702）、芍藥苷對照品（批號0829-9702），中國食品藥品檢定研究院；藁本內(nèi)酯對照品（批號CHB160428，純度95%），成都曼思特股份有限公司。黃芪（批號20170210）、白芍（批號20170510）、熟地黃（批號20170703），甘肅·隴西百寶藥業(yè)有限責(zé)任公司；當(dāng)歸（批號20171201）、桃仁（批號20160901），河北祁新中藥顆粒飲片有限公司；紅花（批號17103004），甘肅省國草藥業(yè)有限公司；川芎（批號170801），成都濟宏藥業(yè)有限公司。水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備

精密稱取復(fù)方藥物，精密加入一定體積分數(shù)的乙醇溶液，超聲提取（頻率40 kHz，功率80%）60 min，放至室溫，補足質(zhì)量，抽濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2 浸膏得率的測定

按“2.1”項下方法，精密量取續(xù)濾液，置于已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，105 ℃干燥3 h，干燥器中放置1 h冷卻至室溫，精密稱定質(zhì)量，計算浸膏得率。

2.3 阿魏酸、藁本內(nèi)酯和芍藥苷含量測定

采用內(nèi)標(biāo)校正法同步測定阿魏酸和藁本內(nèi)酯的含量，以阿魏酸為內(nèi)標(biāo)物，通過相對校正因子（f=0.223 1）計算藁本內(nèi)酯的含量，此方法準(zhǔn)確、有效，并且能降低檢測成本和時間[7]。采用外標(biāo)法測定芍藥苷的含量。

2.3.1 色譜條件

Thermo ODS HYPERSIL C18色譜柱（250 mm×4. 6 mm，5 ?m）；流動相為乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～5 min，5%～10%B；5～15 min，10%～15%B；15～20 min，15%B；20～30 min，15%～25%B；30～50 min，25%～60%B）；流速1.0 mL/min；柱溫25 ℃；阿魏酸檢測波長為323 nm，芍藥苷檢測波長為230 nm，進樣量10 ?L。在上述色譜條件下，供試品溶液中各組分分離度良好，色譜圖見圖1。

2.3.2 對照品溶液的制備

分別精密稱取對照品阿魏酸、芍藥苷及藁本內(nèi)酯0.596、2.276、3.24 mg，分別置于10 mL量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，得到濃度分別為0.059 6、0.227 6、0.324 mg/mL的阿魏酸、芍藥苷及藁本內(nèi)酯對照品溶液，置于4 ℃冰箱保存，備用。分別精密吸取上述對照品溶液2 mL定容于同一5 mL容量瓶中，得混合對照品溶液。按“2.3.1”項下色譜條件進行分析，混合對照品溶液色譜圖見圖2。

2.3.3 線性關(guān)系考察

精密吸取上述阿魏酸對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL分別定容至5 mL容量瓶，精密吸取上述芍藥苷對照品溶液0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL分別定容至5 mL容量瓶，進樣10 ?L，每個濃度平行進樣3次，取峰面積平均值，以濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，平均峰面積積分值為縱坐標(biāo)，進行回歸處理，回歸方程及線性范圍見表1。

2.3.4 精密度試驗

取“2.3.3”項下高、中、低3個濃度的對照品溶液，每個濃度連續(xù)進樣3針，計算峰面積的RSD，結(jié)果阿魏酸峰面積RSD=2.23%，芍藥苷峰面積RSD=1.56%，表明儀器的精密度良好。

2.3.5 重復(fù)性試驗

精密稱取復(fù)方藥物6份，按“2.1”項下方法制備供試品溶液，計算浸膏得率，阿魏酸、芍藥苷提取率及其權(quán)重和。權(quán)重和=阿魏酸提取率×25%+芍藥苷提取率×25%+藁本內(nèi)酯提取率×25%+浸膏得率×25%。結(jié)果RSD=1.83%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液，分別放置0、3、6、12、24 h后進樣分析，每次進樣10 ?L，記錄峰面積，結(jié)果阿魏酸、芍藥苷峰面積的RSD分別為0.538%、1.428%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.7 加樣回收率試驗

精密稱取復(fù)方藥物9份，隨機分為3組，每組分別精密加入低、中、高濃度的對照品溶液，按“2.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.3”項下方法測定阿魏酸、芍藥苷及藁本內(nèi)酯的含量，計算加樣回收率。結(jié)果阿魏酸平均回收率為100.06%，RSD=1.986 7%；芍藥苷平均回收率為99.75%，RSD=1.586 7%。

2.4 提取工藝優(yōu)化

2.4.1 單因素試驗

固定料液比、提取時間及提取溶劑，對比超聲波提取法及回流提取法對復(fù)方當(dāng)歸補血湯的提取效率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)回流提取法的提取效率略高于超聲提取法，但超聲提取法操作簡便，效率較高，因此選擇超聲提取法。在此基礎(chǔ)上，對提取溶劑、料液比及提取時間進行考察。結(jié)果見圖3。

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇乙醇濃度30%～70%、料液比1∶50～1∶100、提取時間30～60 min為考察區(qū)間，進一步采用析因設(shè)計對上述因素進行分析。

2.4.2 二級全析因設(shè)計

析因設(shè)計可以有效控制或消除其他混雜因素對反應(yīng)變量的干擾，分析更準(zhǔn)確，能同時研究幾個因素之間的交互作用，使分析結(jié)果更可靠和穩(wěn)定，為選擇最優(yōu)處理組合提供依據(jù)[8]。因此，本試驗以權(quán)重和為考察指標(biāo)，篩選對復(fù)方藥物提取率有顯著影響的因素，試驗安排及結(jié)果見表2、表3。

由表3可知，乙醇濃度與料液比對浸膏得率有顯著影響（P<0.05），而提取時間為非顯著性影響因素（P>0.05），故將提取時間確定為提取率最高的60 min，進一步采用最速上升試驗對乙醇濃度和料液比進行優(yōu)化。

2.4.3 最速上升試驗

最速上升試驗是沿著最速上升路徑及響應(yīng)有最大增量的方向逐步移動的方法。根據(jù)二級全析因設(shè)計結(jié)果，選擇乙醇濃度（A）與料液比（B）為考察因素，以權(quán)重和為評價指標(biāo)，確定兩者的基本步長分別為10%與1∶10，試驗設(shè)計見表4，試驗結(jié)果見圖4。可以看出，權(quán)重和的最高值在第3組，即乙醇濃度為50%、料液比為1∶80，故將其作為響應(yīng)面試驗的中心試驗點。

2.4.4 中心組合設(shè)計-響應(yīng)面法設(shè)計及結(jié)果

根據(jù)最速上升試驗確定的響應(yīng)面試驗中心點，以權(quán)重和為評價指標(biāo)進行設(shè)計，采用Design Expert8.0軟件對結(jié)果進行分析處理，因素和水平見表5，試驗設(shè)計和結(jié)果見表6。

對表6試驗結(jié)果數(shù)據(jù)進行多元二次回歸擬合，得回歸方程Y=0.17-7.466×10-3A+0.029B-0.033AB（r=0.914 9，P<0.000 1）。根據(jù)確立的多項式模型，繪制乙醇濃度和料液比對權(quán)重和的二維等高線圖和三維效應(yīng)曲面圖，并優(yōu)選2個因素的最佳取值范圍，結(jié)果見圖5。

由圖5可以看出，最佳提取條件為：超聲提取60 min，提取溶劑為36%乙醇，料液比為1∶94。對優(yōu)選的提取條件進行3次平行驗證，結(jié)果權(quán)重和為0.23，預(yù)測值為0.239 2，RSD=2.77%，表明該模型預(yù)測性良好，提取條件重復(fù)性理想。

3 討論

復(fù)方當(dāng)歸補血湯以黃芪、當(dāng)歸為君藥，黃芪補益元氣，當(dāng)歸補血活血；桃仁、紅花為臣藥，增強活血祛瘀功效；川芎理血中之氣，行血活血，為血中之氣藥；白芍養(yǎng)血柔肝、緩急止痛；熟地黃補血滋陰。全方在益氣生血的基礎(chǔ)上兼能行血通瘀，在臨床應(yīng)用過程中收到良好的效果，具有開發(fā)成為醫(yī)院院內(nèi)制劑的良好潛力，故對其提取工藝進行優(yōu)化尤為必要。

中藥復(fù)方由若干藥味組成，對其提取工藝優(yōu)化時僅針對某一藥味的單一成分進行考察，會導(dǎo)致有效成分的損失和提取工藝的片面性。因此，本試驗選擇方中主要藥味的主要成分阿魏酸、芍藥苷、藁本內(nèi)酯及浸出物得率為考察指標(biāo)，這些成分的藥理活性基本代表了復(fù)方的功效，計算時取其權(quán)重和，能夠較為綜合反映提取工藝的優(yōu)劣；本試驗采用單因素試驗選取各因素的水平范圍，采用析因設(shè)計篩選出乙醇濃度與料液比對試驗結(jié)果具有顯著影響，進而采用最速上升試驗找到各因素的合適取值，以此為中心組合設(shè)計-響應(yīng)面法的中心試驗點對乙醇濃度與料液比進行優(yōu)化，得到最佳提取條件。中心組合設(shè)計-響應(yīng)面法能通過非線性模型擬合來預(yù)測最佳試驗條件，克服了正交設(shè)計、均勻設(shè)計等預(yù)測性較差、精確度不高的不足之處。同時，與析因設(shè)計、最速上升試驗結(jié)合使用，能使工藝條件得到最大程度的優(yōu)化。以此模式對中藥及其復(fù)方的提取工藝進行優(yōu)化，能夠較為全面地篩選出最優(yōu)提取工藝，提高其利用效率，為其進一步開發(fā)利用和產(chǎn)品研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2017-09-19）

（修回日期：2017-10-23；編輯：陳靜）