針刺“三陰交”“百會”對注意缺陷多動障礙大鼠行為學及前額葉皮質中單胺類神經遞質的影響

倪新強 廖穎釗 李利民

摘要：目的 觀察針刺“三陰交”“百會”對注意缺陷多動障礙（ADHD）模型大鼠行為學及前額葉皮質中多巴胺（DA）、去甲腎上腺素（NE）、5-羥色胺（5-HT）含量的影響，探討針刺防治ADHD的作用機制。方法 4周齡SHR大鼠隨機分為模型組、西藥組、針刺組，同周齡WKY大鼠設為正常組，每組10只，針刺組針刺大鼠“三陰交”“百會”，留針15 min；西藥組大鼠每日予利他林2 mg/kg灌胃，在大鼠夜周期連續干預4周。采用開場實驗、高架十字迷宮、新物體識別實驗評估大鼠自發性行為、沖動行為及學習記憶能力，高效液相色譜法檢測前額葉皮質中DA、NE、5-HT水平。結果 與正常組比較，模型組大鼠各項行為學參數均明顯升高（P<0.05），前額葉皮質中DA、NE及5-HT水平明顯降低（P<0.05）；與模型組比較，針刺組大鼠開場實驗總運動距離、理毛次數及直立次數，高架十字迷宮開放臂進入次數百分比和開放臂停留時間百分比均明顯減少（P<0.05），新物體識別實驗對新物體偏好指數明顯增高（P<0.05），前額葉皮質中NE、5-HT水平明顯升高（P<0.05）。結論 針刺“百會”“三陰交”可減少ADHD模型大鼠自發性活動及沖動行為，增強其學習記憶能力，其機制可能與提高前額葉皮質中NE、5-HT水平相關。

關鍵詞：注意缺陷多動障礙；針刺；去甲腎上腺素；5-羥色胺；多巴胺；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.09.010

中圖分類號：R245 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）09-0039-05

Abstract： Objective To observe the effects of acupuncture at “Sanyinjiao” （SP6） and “Baihui” （GV20） on behaviors and contents of monoamine neurotransmitter dopamine （DA）， noradrenalin （NE） and 5-hydroxytrypamine （5-HT） in prefrontal cortex （PFC） of attention deficit hyperactivity disorder （ADHD） rats； To discuss mechanism of action of acupuncture for prevention and treatment of ADHD. Methods 4-week-old SHR rats were randomly divided into the model group， Western medicine group and acupuncture group， and WKY rats with the same age were selected as the normal control group， with 10 rats in each group. Acupuncture was applied to “Sanyinjiao” （SP6） and “Baihui” （GV20） of rats in acupuncture group for 15 min. The rats in Western medicine group was given MPH （ritalin） for gavage， and rats were treated for 4 weeks in the dark-phase. Open field test （OFT）， elevated plus maze （EPM） and novel object recognition test （NORT） were conducted to evaluate the spontaneous activity， impulsivity and learning-memorial ability of rats individually at the end of treatment. Contents of DA， NE and 5-HT in PFC were detected by HPLC. Results Compared with the normal control group， all of the behavior parameters of rats in model group were significantly higher （P<0.05）， and the contents of DA， NE and 5-HT in PFC of model group were lower than those of normal control group （P<0.05）. Compared with the model group， acupuncture group showed shorter movement distance， less rearing and fewer grooming activities in the OFT； percentages of times of entering the open arms and staying duration were reduced in the total period in the EPM； preference index in the NORT was elevated （P<0.05）； the contents of NE and 5-HT in PFC of acupuncture group increased significantly （P<0.05）. Conclusion Acupuncture at “Sanyinjiao” （SP6） and “Baihui” （GV20） canreduce the spontaneous activity and impulsivity， and improve learning and memory ability of ADHD model rats， which may be related to elevated contents of NE and 5-HT in the PFC.

Keywords： attention deficit hyperactivity disorder； acupuncture； noradrenalin； 5-hydroxytrypamine； dopamine； rats

注意缺陷多動障礙（attentional deficit hyperactivity disorder，ADHD）為兒童期最常見的行為障礙性疾病，目前，常規西藥治療不良反應較大。研究發現，由前額葉皮質、尾狀核及小腦組成調控注意、情緒及行為的神經網絡參與了ADHD病機發展[1]，與此神經網絡相關神經元功能紊亂導致的單胺類神經遞質如多巴胺（DA）、去甲腎上腺素（NE）及5-羥色胺（5-HT）活動改變進一步導致ADHD的病理改變[2]。大量臨床研究表明，針刺單用或配合常規藥物及行為療法治療ADHD優于單純常規藥物和行為療法[3-4]，但其作用機制迄今尚未見報道。因此，本實驗觀察針刺對ADHD模型大鼠行為學（自發性活動、沖動、學習記憶）的影響，初步探討其是否通過調控前額葉皮質中DA、NE及5-HT水平發揮其療效，為臨床上用于治療ADHD提供依據。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

SPF級SHR大鼠40只，WKY大鼠10只，均為雄性，3周齡，體質量（40±10）g，北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物許可證號SCXK（京）2012-0001。飼養于明暗交替12 h/12 h、溫度20～22 ℃、相對濕度（50±10）%的SPF級動物房，自由攝食飲水。動物適應性喂養5 d后編號，先采用開場實驗觀察大鼠自發性行為[5]，按動物5 min內總運動距離分層隨機區組設計[6]，Excel2010產生隨機數字，將動物按5 min內總運動距離升序排序，按順序每3只動物分為1個區組，共分成10個區組，每一區組中3只大鼠再按隨機數升序依次分入3個隨機組中，3個隨機組中每組分到10只動物，進而將SHR大鼠分為模型組、西藥組、針刺組，每組10只。WKY大鼠作為正常組。

1.2 主要試劑與儀器

標準品DA（批號H8502）、NE（批號A7257）和5-HT（批號H9523），色譜甲醇、色譜乙腈，美國Sigma公司；乙二胺四乙酸、磷酸二氫鉀，北京索萊寶科技有限公司。開場試驗箱（63007型）、高架十字迷宮（63009型）、Barnes迷宮（63027型）、SMART 3.0小動物行為學視頻采集與分析系統，美國Panlab公司；Agilent1100高效液相色譜系統，美國Agilent公司；CoulochemⅢ電化學檢測器，美國ESA公司；Q700智能型超聲波破碎儀，美國Qsonica公司；華佗牌無菌一次性針具，蘇州醫療用品廠有限公司，規格0.16 mm×7 mm。

1.3 干預

適應性喂養1周后開始干預。針刺組：用特制棉布袋將大鼠立位固定于木架上，暴露四肢，取“百會”“三陰交”，定位及針刺操作參照《實驗針灸學》[7]。“百會”向尾部斜刺，“三陰交”向后爪部斜刺5 mm，每穴行均勻捻轉刺激30 s；施針時用手輕輕安撫大鼠固定其頭部，減少額外刺激；留針15 min，間隔5 min行針1次，頻率120～150 次/min，每日1次。正常組和模型組均以相同方法束縛但不進行針刺。西藥組：利他林（MPH速釋劑型，購于Novartis，批號NDC 0078-0440-05）每日灌胃2 mg/kg，用0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）配制成混懸液，超聲溶解，1日量分2次灌胃（大鼠夜周期9：30-10：30、15：30-16：30時）。連續干預4周。20 W可夾式紅色電燈用以在抓取動物、行針及灌胃時照明[8]。

1.4 行為學檢測

當日首次給藥30 min后在大鼠夜周期進行行為學測試。動物分組對動物行為學操作人員設盲，過程中保持周邊光線和噪聲的一致性；每只大鼠測試完后用75%乙醇及時擦拭迷宮，清除糞便及氣味，以免干擾下只大鼠測試。

1.4.1 開場實驗

采用內壁100 cm×100 cm×50 cm的木質敞箱，通過軟件將箱底設置成25個方格（20 cm×20 cm）。測試開始時將大鼠放在開場箱底部中央，通過視頻分析系統自動記錄其5 min內總運動距離（cm）、直立次數（大鼠前爪騰空或攀附開場箱側壁計為1次）、理毛次數及排糞次數。

1.4.2 高架十字迷宮

高架十字迷宮由2個開放臂（30 cm×5 cm）和2個閉合臂（30 cm×5 cm×40 cm）組成，整個設備高于地面50 cm。測試時將大鼠頭朝開放臂方向放在四臂交叉的中央區，高架十字迷宮頂部強光源始終打開。記錄5 min內活動指標：開放臂進入次數（必須2只前爪進入臂內）、開放臂停留時間、閉合臂進入次數、閉合臂停留時間、高架十字迷宮總進入次數、開放臂進入次數比（開放臂進入次數與迷宮總進入次數比值）、開放臂停留時間比（開放臂進入時間與迷宮總進入時間比值）。

1.4.3 新物體識別實驗

新物體識別實驗是基于哺乳類動物易趨向于新穎事物的天性而評估學習記憶功能[9]。測試流程分訓練期及測試期：在訓練期，測試箱內放入形狀、顏色及大小相同的2個物體，對稱固定于底部對角線上（外1/3處），然后將大鼠背朝兩物體（大鼠鼻尖距離兩物體的長度一致）放入測試箱3 min，當大鼠嘴部或鼻部朝向物體且在距離物體1 cm范圍內時，即被認為探索物體，記錄大鼠在此階段對2個相同物體的探索時間；1 d后進入測試期，將其中一物體換成顏色和形狀均不相同但大小相同的新穎物體（保持新物體在測試盒內位置不變），記錄5 min內大鼠對新穎物體與熟悉物體的探索時間。采用偏好指數（preference index，PI），即大鼠在訓練期探索其中一個物體或測試期探索新物體的時間與探索兩物體總時間的比值作為評價大鼠記憶能力的指標。

1.5 單胺類神經遞質含量測定

末次給藥后1 h，CO2麻醉斷頭處死大鼠，根據大鼠腦立體定位圖，冰臺上快速剖取大腦，分離出前額葉皮質，冰生理鹽水清洗，濾紙吸干表面水分。稱取100 mg左右前額葉皮質，放入1 mL冰冷0.1 mol/L高氯酸溶液（含0.5 mmol /L EDTA、0.01%半胱氨酸）中，冰浴中勻漿離心（4 ℃、3000×g，20 min，取上清液繼續離心（室溫、12 000×g，3 min），取上清液、以針頭式過濾器（0.45 μm）過濾，取濾液以去離子雙蒸水1∶4稀釋后進行NE、5-HT和DA高效液相-電化學檢測。檢測條件：色譜柱采用Phenomenex Luna C18反相柱（50 mm×2.0 mm×3 μm），流動相含磷酸二氫鈉49.9 mmol/L、EDTA 200 μmol/L、辛烷磺酸鈉鹽0.2 mmol/L、氯化鈉9.9 mmol/L、甲醇100 mL、超純水（pH 2.6）900 mL，流速1.0 mL/min，柱溫35 ℃，工作電壓0.7 V。所有數據重復3次。

1.6 統計學方法

采用SPSS19.0統計軟件進行分析。實驗數據以—x±s表示。對數據進行正態分布檢驗及組間方差齊性檢驗，符合正態分布且方差齊，組間比較用方差分析，數據不符合正態分布或方差不齊則用非參數檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 針刺對SHR大鼠自發性活動的影響

與正常組比較，模型組大鼠總運動距離、直立次數、理毛次數及排糞次數明顯增加（P<0.05）；與模型組比較，針刺組和西藥組大鼠總運動距離、直立次數及理毛次數明顯減少（P<0.05），針刺組大鼠總運動距離少于西藥組（P<0.05），兩組直立次數比較差異無統計學意義（P>0.05）；各組SHR大鼠排糞次數比較差異無統計學意義（P>0.05）。結果見表1。

2.2 針刺對SHR大鼠沖動行為的影響

各組SHR大鼠進入開放臂次數比及開放臂停留時間比較正常組均明顯增加（P<0.05）；西藥組及針刺組大鼠開放臂進入次數比及開放臂停留時間比較模型組均明顯減少（P<0.05）；針刺組大鼠較西藥組開放臂停留時間比明顯減少（P<0.05）。結果見表2。

2.3 針刺對SHR大鼠學習記憶能力的影響

在訓練期，各組大鼠對2個相同物體探索時間相似（P>0.05），對物體無明顯偏好選擇。在測試期，各組SHR大鼠PI均明顯高于正常組（P<0.05），針刺組大鼠對新物體探索時間較模型組明顯增加（P<0.05）。結果見表3。

2.4 針刺對SHR大鼠前額葉皮質中單胺類神經遞質的影響

與正常組比較，模型組大鼠DA、NE、5-HT含量明顯降低（P<0.05）；與模型組比較，針刺組和西藥組大鼠NE、5-HT含量明顯增加（P<0.05）。結果見表4。

3 討論

ADHD屬中醫學“臟躁”“煩躁”等范疇。《素問·陰陽應象大論篇》謂“陰靜陽躁”，即陰主柔靜，陽主剛躁，兩者充盛和諧，則機體調節功能（如動與靜、興奮與抑制、亢進與減退等）協調無病。小兒ADHD系由陰陽動靜失衡而致，即陰靜不足，陰不制陽而致神不靈、魂不安、意不固、志不堅。《靈樞·根結》云：“用針之要，在于知調陰與陽。”故針刺治療ADHD應以頭部腧穴及陰經腧穴為主，以期益精填髓、調和陰陽、安神定志。交會穴為多經經氣匯聚之處，可起到調諸經的目的。“病變在腦，首取督脈”，而百會為督脈、足太陽、足少陽、手少陽及足厥陰之會，百會又可通過足太陽經的背俞穴與五臟六腑經氣相通，取之能填精益髓、疏通腦絡、醒神開竅；三陰交為足三陰之會，可通調肝、脾、腎臟腑精氣。故合用百會、三陰交治療ADHD，可達通督調神、益智復聰之功。因此，臨床治療兒童ADHD時多注重對這兩穴的應用，以提高療效。

本實驗選擇在逆轉的暗周期（大鼠清醒周期）里，對動物進行MPH治療及其他干預，以模仿臨床MPH用藥方案（ADHD患兒在晝夜節律的“活動期”接受MPH治療）[10-11]。開場實驗的總運動距離、直立次數、理毛次數分別反映動物的自發性活動、對新奇環境的探究程度及情緒緊張程度。本研究發現，針刺可明顯減少SHR大鼠在逆轉的暗周期運動距離、直立次數及理毛次數，而對同樣反映情緒緊張程度的排糞次數沒有影響。焦慮相關的沖動采用高架十字迷宮評估，進入開放臂次數及停留時間的增加可能反映了沖動[12-13]，本研究中SHR大鼠進入開放臂次數及停留時間均多于正常組WKY大鼠，表明SHR大鼠可表現出ADHD樣的沖動行為；MPH及針刺均能減少SHR大鼠進入開放臂次數及停留時間，針刺更能減少SHR大鼠進入開放臂停留時間，表明針刺較MPH更能減輕SHR大鼠的沖動行為。

有研究發現，3周齡大鼠（品系不詳）連續21 d（周末停用）口服MPH3（5 mg/kg，每日2次），大鼠未表現出對新穎物體明顯偏好[14]，而Heyser C J等[15]也發現對斷乳期（21日齡）和圍青春期（34日齡）的SD大鼠連續7 d腹腔注射MPH（5 mg/kg，每日2次），可損傷其識別記憶功能，但因腹腔注射釋放藥物較迅速，其給藥途徑對神經系統的影響與藥物口服可能不同[16]。而本研究中，西藥組與針刺組大鼠對新穎物體PI顯著高于模型組，表明長期口服MPH及針刺治療均可增強SHR大鼠記憶能力，而MPH對SHR大鼠記憶學習能力改善結果與上述報道不同，可能與MPH給藥途徑、動物品系等不同有關。

ADHD病理機制尚未明確，研究發現腦組織內主要神經遞質（如DA、5-HT）與沖動行為的調控有關[17-18]，背側紋狀體DA信號中多巴胺D1受體降低可減輕沖動，青春期長期給予MPH可增強SHR大鼠內側前額葉皮質中DA轉運體功能，而MPH治療停止后仍可減少成年期細胞外DA的水平[19]。降低的中樞5-HT信號增加大鼠沖動行為及選擇，中縫背核5-HT神經元的藥理學及光遺傳活化可降低選擇沖動[20]。學習記憶部分依賴于前額葉皮質的功能整合，其很大程度上依賴于突觸DA及NE的最優水平；研究發現，SHR大鼠前額葉皮質中NE釋放減少[21]，而MPH被認為可保持DA及NE的水平。可恢復體內兒茶酚胺釋放未達最優水平個體的認知功能[22]。本研究中，針刺組及西藥組大鼠前額葉皮質中NE、5-HT較模型組明顯升高（P<0.05），針刺組大鼠前額葉皮質中DA含量與模型組比較差異無統計學意義，表明針刺“百會”“三陰交”可能通過增加SHR大鼠前額葉皮質中NE、5-HT含量而減輕大鼠夜周期多動及沖動行為、增強大鼠學習記憶能力。

參考文獻：

[1] VIEIRA D E， MELO B B， TRIGUEIRO M J， et al. Systematic overview of neuroanatomical differences in ADHD：definitive evidence[J]. Developmental Neuropsychology，2018，43（1）：52-68.

[2] SHARMA A， COUTURE J. A review of the pathophysiology， etiology， and treatment of attention-deficit hyperactivity disorder （ADHD）[J]. Ann Pharmacother，2014，48（2）：209-225.

[3] 何彩娣，郎伯旭，金靈青，等.頭針聯合腦電生物反饋療法治療兒童注意缺陷多動障礙：隨機對照研究[J].中國針灸，2014，34（12）：1179- 1183.

[4] 倪新強，張艷莉，韓新民，等.針刺治療注意力缺陷多動障礙的Meta分析[J].針刺研究，2015，40（4）：319-325.

[5] PRUT L， BELZUNG C. The open field as a paradigm to measure the effects of drugs on anxiety-like behaviors：a review[J]. Eur J Pharmacol，2003，463（1/2/3）：3-33.

[6] 魚達，李輝，姜驪.實驗動物隨機分組的計算機程序處理[J].實驗動物科學，2011，28（1）：25-27.

[7] 張露芬.實驗針灸學[M].北京：化學工業出版社，2010：221.

[8] MASSOF R W， JONES A E. Electroretinographic evidence for a photopic system in the rat[J]. Vision Res，1972，12（7）：1231-1239.

[9] DERE E， HUSTON J P， SILVA M A D S. The pharmacology， neuroanatomy and neurogenetics of one-trial object recognition in rodents[J]. Neurosci Biobehav Rev，2007，31（5）：673-704.

[10] GOMES K M， SOUZA R P， INACIO C G. Evaluation of light/dark cycle in anxiety- and depressive-like behaviors after regular treatment with methylphenidate hydrochloride in rats of different ages[J]. Rev Bras Psiquiatr，2011，33（1）：55-58.

[11] GAYTAN O， YANG P， SWANN A， et al. Diurnal differences in sensitization to methylphenidate[J]. Brain Res，2000，864（1）：24-39.

[12] UENO K I， TOGASHI H， MORI K， et al. Behavioural and pharmacological relevance of stroke-prone spontaneously hypertensive rats as an animal model of a developmental disorder[J]. Behav Pharmacol，2002，13（1）：1-13.

[13] LANGEN B， DOST R. Comparison of SHR， WKY and Wistar rats in different behavioural animal models：effect of dopamine D1 and alpha2 agonists[J]. Atten Defic Hyperact Disord，2011，3（1）：1-12.

[14] LEBLANC-DUCHIN D， TAUKULIS H K. Chronic oral methylphenidate administration to periadolescent rats yields prolonged impairment of memory for objects[J]. Neurobiol Learn Mem，2007， 88（3）：312-320.

[15] HEYSER C J， PELLETIER M， FERRIS J S. The effects of methylphenidate on novel object exploration in weanling and periadolescent rats[J]. Ann N Y Acad Sci，2004，1021：465-469.

[16] KUCZENSKI R， SEGAL D S. Stimulant actions in rodents：implications for attention-deficit/hyperactivity disorder treatment and potential substance abuse[J]. Biol Psychiatry， 2005，57（11）：1391-1396.

[17] BIZOT J， LE BIHAN C， PUECH A J， et al. Serotonin and tolerance to delay of reward in rats[J]. Psychopharmacology （Berl），1999， 146（4）：400-412.

[18] EAGLE D M， LEHMANN O， THEOBALD D E， et al. Serotonin depletion impairs waiting but not stop-signal reaction time in rats：implications for theories of the role of 5-HT in behavioral inhibition[J]. Neuropsychopharmacology，2009，34（5）：1311-1321.

[19] SOMKUWAR S S， DAMA M， KANTAK K M， et al. Adolescence methylphenidate treatment in a rodent model of attention deficit/hyperactivity disorder：dopamine transporter function and cellular distribution in adulthood[J]. Biochemical Pharmacology， 2013，86（2）：309-316.

[20] MIYAZAKI K W， MIYAZAKI K， DOYA K. Activation of dorsal raphe serotonin neurons is necessary for waiting for delayed rewards[J]. J Neurosci，2012，32（31）：10451-10457.

[21] HEAL D J， SMITH S L， KULKARNI R S， et al. New perspectives from microdialysis studies in freely-moving， spontaneously hypertensive rats on the pharmacology of drugs for the treatment of ADHD[J]. Pharmacol Biochem Behav，2008，90（2）：184-197.

[22] ARNSTEN A F， LI B M. Neurobiology of executive functions：catecholamine influences on prefrontal cortical functions[J]. Biol Psychiatry，2005，57（11）：1377-1384.

（收稿日期：2018-03-25）

（修回日期：2018-04-08；編輯：華強）