補腎活血針刺法對SAMP8小鼠學習記憶能力及海馬內源性神經干細胞增殖的影響

薩依臘西·杰恩斯努爾 肖嵐 龍見汝

摘要：目的 觀察補腎活血針刺法對阿爾茨海默?。ˋD）模型SAMP8小鼠行為學及海馬內源性神經干細胞增殖的影響。方法 將18只7月齡雄性SAMP8小鼠作為AD模型，隨機分為針刺組、非穴組和模型組，另取同月齡雄性SAMR1小鼠6只作為正常組。針刺組小鼠選取“腎俞”“百會”“血?！薄半跤帷边M行針刺干預，非穴組小鼠取雙側肋下固定非穴點進行針刺，模型組和正常組小鼠予相同程度捉抓刺激，連續干預8周。采用水迷宮實驗檢測小鼠學習記憶能力，免疫組化檢測海馬BrdU陽性細胞數。結果 與正常組比較，模型組小鼠逃避潛伏期明顯延長（P<0.05），停留在原平臺象限時間明顯縮短（P<0.05），BrdU陽性細胞數明顯減少（P<0.05）；與模型組、非穴組比較，針刺組小鼠逃避潛伏期明顯縮短（P<0.05），停留在原平臺象限時間明顯延長（P<0.05），BrdU陽性細胞數明顯增加（P<0.05）。結論 補腎活血針刺法可能通過誘導海馬內源性神經干細胞的增殖，改善AD模型SAMP8小鼠的學習記憶能力。

關鍵詞：補腎活血；針刺；阿爾茨海默?。簧窠浉杉毎鲋?；SAMP8小鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.09.009

中圖分類號：R245 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）09-0035-04

Abstract： Objective To investigate the effects of Bushen Huoxue acupuncture method on the behavioral changes and the proliferation of endogenous neural stem cells （NSCs） in hippocampus of Alzheimer disease （AD） model mice. Methods 18 male SAMP8 mice， seven months old， were randomly divided into acupuncture group， non-acupoint control group， and model control group. And another age-matched 6 male SAMR1 mice were prepared as normal control group. Mice in acupuncture group were intervened by acupuncture method in the acupoints of “Shenshu”， “Baihui”， “Xuehai”， and “Geshu”. Mice in non-acupoint control group were treated by stimulating the fixed non-point under the bilateral rib， while mice in model control group and normal control group were raised without special treatment but administered the stimulation of catching with the same time and the same stimulus intensity. All treatrment lasted for 8 weeks. After the intervention， the learning and memory abilitities and brain hippocampus BrdU positive cells of all groups were detected. Results Compared with the nomal control group， mice in the model control group had longer escape latency and less time spent in former platform quadrant （P<0.05）； the number of BrdU positive cells decreased significantly （P<0.05）. Compared with the model control group and the non-acupoint control group， mice in the acupuncture group had shorter escape latency and more time spent in former platform quadrant （P<0.05）； the number of BrdU positive cells increased significantly （P<0.05）. Conclusion Bushen Huoxue acupuncture method can improve the learning and memory abilities of SAMP8 mice AD model by inducing the proliferation of hippocampal endogenous NSCs.

Keywords： Bushen Huoxue； acupuncture method； Alzheimer disease； NSCs proliferation； SAMP8 mice

阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）是一種與年齡相關的復雜性神經性疾病，以認知功能進行性減退為特征[1]。本課題組前期研究發現，補腎活血法對AD認知障礙和病情發展有一定的控制作用[2]；補腎活血針刺法通過抗氧化應激、調節β淀粉樣蛋白代謝、抑制神經反應及修復細胞骨架等方面的作用改善AD模型小鼠的學習記憶能力[3-4]。神經干細胞（neural stem cell，NSCs）是一類具有自我產生新細胞及分化能力的多能干細胞，其相關研究已成為神經學科領域熱點。本實驗在前期研究基礎上，采用Morris水迷宮實驗和免疫組化方法，觀察補腎活血針刺法對AD模型SAMP8小鼠行為學及海馬內源性NSCs增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

清潔級雄性7月齡SAMP8小鼠18只、SAMR1小鼠6只，體質量（28±1.5）g，購于天津中醫藥大學第一附屬醫院動物實驗中心，動物質量合格證號0001353。飼養于中南大學湘雅三醫院實驗動物中心，溫度20～23 ℃，相對濕度55%～58%，每日12 h照明，自由攝食飲水，單籠通氣通風。所有小鼠適應性飼養7 d，AD模型SAMP8小鼠隨機分為針刺組、非穴組和模型組，每組6只，6只SAMR1小鼠為正常組。

1.2 主要試劑與儀器

BrdU粉末，美國Sigma；Rat-anti-BrdU，美國Serotec；Goat-anti-rat IgG，德國Vector Laboratories；ABC試劑，德國Vector Laboratories。移液槍，美國Eppendoff；0.30 mm×25 mm華佗牌一次性針灸針，蘇州醫療用品廠有限公司；Morris水迷宮，中南大學湘雅三醫院動物實驗中心；光學顯微鏡及彩色圖像分析系統，日本Olympus。

1.3 干預

針刺組用補腎活血針刺法進行干預，選取“百會”（頂骨正中，即頭頂兩耳根連線的中點）、“血?！保ê笾蓛葌戎虚g，髕底內側端至恥骨聯合連線下1/9處）、“腎俞”（第2腰椎下兩旁）及“膈俞”（第7胸椎下兩旁肋間）?！鞍贂毕蚯捌酱?～4 mm，施捻轉平補平瀉法；“腎俞”直刺2～3 mm，施捻轉補法；“血?！敝贝?～3 mm，施捻轉瀉法；“膈俞”以80°角斜向上刺2～3 mm，施捻轉瀉法。每個施針穴位間歇5 min，捻轉1次。其中“腎俞”“膈俞”“血?！毕柔槾套髠?，隔日再針刺右側。小鼠穴位定位及針刺深度均參照“動物針灸穴位圖譜”[5]。補瀉手法參照石學敏院士制定的針刺手法量學標準，即針刺后開始捻轉時拇指向順時針捻轉為補，逆時針則為瀉[6]。非穴組參照韓景獻教授經驗采取針刺雙側脅下固定非穴位點作為對照刺激點，斜刺進針2～3 mm，用平補平瀉捻轉手法進行干預，先針刺左側，隔日再針刺右側[7]。模型組和正常組每日參照針刺組以同樣方式和程度、在相同時間進行抓取和固定。各組小鼠每日處理1次，連續6 d，第7日休息，連續8周。

1.4 行為學檢測

干預結束后采用Morris水迷宮實驗進行行為學測試。隱蔽平臺實驗：將平臺放置于第2象限，將小鼠置于平臺15 s，并依次從第1、3、4象限入水點投放小鼠，記錄該鼠找到平臺的時間，即為逃避潛伏期。如小鼠超過60 s尚未找到平臺，則由實驗者將小鼠引至平臺，并讓小鼠在平臺上停留15 s，逃避潛伏期記為60 s。空間探索實驗：撤去平臺，由第4象限入水，觀察小鼠60 s內無平臺條件下尋找記憶中平臺游泳軌跡，記錄小鼠在原平臺象限的停留時間。

1.5 BrdU標記法及取材

處死動物前7 d，小鼠腹腔注射BrdU（50 mg/kg），每日1次，連續7 d。BrdU溶于含有0.28 g/L氫氧化鈉的生理鹽水，配制BrdU濃度為5 mg/mL。注射BrdU藥物1周后第2日，麻醉腦組織取材，4%多聚甲醛固定，脫水，包埋，腦組織冠狀冰凍切片（厚度30 μm），用于BrdU免疫組化檢測。

1.6 免疫組化檢測

腦切片復溫30 min，PBS洗3次；3%H2O2封閉10 min；PBS洗3次。甲酰胺65 ℃水浴40 min抗原修復，PBS洗3次；2 mol/L鹽酸37 ℃水浴40 min解開DNA雙鏈，PBS洗3次；0.01 mmol/L Tris-HCL修復，PBS洗3次；滴加BrdU一抗（1∶4000），4 ℃冰箱保存。滴加Goat-anti-rat IgG（1∶400）二抗，室溫孵育2 h；PBS洗3次；滴加ABC試劑（1∶400）三抗，室溫孵育2 h；PBS洗3次；DAB顯色，蘇木素染核；脫水，透明，封片。鏡下采集圖像并計數，隨機選5個視野觀察，計數海馬及海馬周圍BrdU陽性表達。

1.7 統計學方法

采用SPSS19.0統計軟件進行分析。實驗數據以—x±s表示。采用方差分析，方差齊兩兩比較用LSD或SNK檢驗，方差不齊用秩和檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 補腎活血針刺法對SAMP8小鼠Morris水迷宮實驗學習能力的影響

與正常組比較，模型組小鼠逃避潛伏期明顯延長（P<0.05）；與模型組、非穴組比較，針刺組逃避潛伏期明顯縮短（P<0.05）。結果見表1。

2.2 補腎活血針刺法對SAMP8小鼠Morris水迷宮實驗記憶能力的影響

與正常組比較，模型組小鼠停留在原平臺象限時間明顯縮短（P<0.05）；與模型組、非穴組比較，針刺組小鼠停留在原平臺象限時間明顯延長（P<0.05）。結果見表2。

2.3 補腎活血針刺法對SAMP8小鼠海馬內源性神經干細胞增殖的影響

免疫組化染色結果顯示，海馬BrdU陽性表達主要分布在齒狀回的顆粒細胞下層，BrdU陽性表達為細胞漿或細胞核為棕褐色或淡黃色，細胞呈散在分布，見圖1。與正常組比較，模型組小鼠腦內海馬BrdU陽性細胞數明顯減少（P<0.05）；與模型組、非穴組比較，針刺組小鼠腦內海馬BrdU陽性細胞數明顯增加（P<0.05），見表3。

3 討論

NSCs具有自我更新能力，正常情況下處于靜止狀態，受到刺激或病理情況下，其增殖能力增強，并可分化各種存在于動物胚胎中和成年人的中樞神經系統內的特殊神經細胞。內源性NSCs常多見于動物腦內的海馬、紋狀體、皮質、嗅球及側腦室下區等部位。本研究采用BrdU標記法，其作為體現細胞增殖較為理想的指標，BrdU陽性細胞可看作增殖的內源性NSCs。BrdU標記時給藥劑量太小，陽性細胞數量少、著色淡，因而不容易辨別，給藥劑量太大則毒性大反而會減少陽性細胞數。有研究認為，BrdU給藥劑量為50 mg/kg時，可保證攝取足夠的BrdU數用于新生細胞DNA的合成[8]。本實驗標記NSCs增殖的BrdU注射液劑量為50 mg/kg，切片經熱抗原修復、DNA變性、解鏈后，目的細胞顯色好，易于辨認計數，保證實驗結果的準確可靠。

多項實驗研究表明，針刺可改善老年癡呆模型動物的記憶和認知障礙[9-12]。本研究結果顯示，隱蔽平臺實驗針刺組較模型組、非穴組逃避潛伏期明顯縮短，空間探索實驗針刺組小鼠停留在原平臺象限時間較模型組、非穴位組明顯延長，表明補腎活血針刺法刺激可改善AD模型SAMP8小鼠的學習記憶能力。BrdU免疫組化結果顯示，針刺組小鼠腦內海馬BrdU陽性細胞數較模型組、非穴組明顯增加，表明補腎活血針刺法刺激可誘導AD模型SAMP8小鼠腦內內源性NSCs的增殖。

補腎活血為針刺法的選穴依據，百會是手少陽、足太陽、足少陽、足厥陰之交會穴，位于腦部巔頂處，是所有陽脈的交匯之處，內應于腦，是調節腦功能的要穴。有研究發現，電針“百會”可改善APP/PS1轉基因小鼠的認知損傷[13]，提高APP/PS1雙轉基因AD模型小鼠的記憶能力[14]。腎俞位于足太陽膀胱經經脈上，有益腎固精、疏通經絡、調節大腦的作用。膈俞為八會穴之血會，有活血功效，臨床上常與血海配伍治療多種血瘀病證?，F代研究表明，電針“百會”“腎俞”“膈俞”對擬血管性癡呆小鼠的腦缺血缺氧及腦水腫狀態有明顯的改善作用[15]。血海為血證要穴，能補血活血。有研究發現，針刺“血海”可不同程度地影響大鼠血液高凝聚狀態、血流狀態及毛細血管狀態，進而改善機體的微循環、新陳代謝及臟器功能的平衡等[16]。我們前期采用蛋白質組學的方法研究發現，以補腎活血為針刺法干預SAMP8小鼠可調節其杏仁核內相關氧化應激、線粒體能量等多種蛋白質的表達[17]。結合本實驗結果，我們推測補腎活血針刺法可通過誘導腦內源性NSCs增殖而促進神經損傷修復、改善AD模型SAMP8小鼠的學習和記憶功能，進而為針灸治療AD的研究提供新的思路和理論依據。

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（收稿日期：2018-01-25）

（修回日期：2018-03-20；編輯：華強）