2,4-二氯苯氧乙酸在線免疫傳感器監(jiān)測技術(shù)的應(yīng)用研究

余瓊珍, 張鋮麟, 朱志華, 崔婉俊,劉廣立*, 宋保棟, 王 偉, 葉 波

(1.肇慶市環(huán)境保護監(jiān)測站(肇慶市環(huán)境科學(xué)研究所),廣東,肇慶 526040;2.中山大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,廣東,廣州 510006; 3.北京金達(dá)清創(chuàng)環(huán)境科技有限公司,北京 100084)

0 引 言

2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)是一種廣泛應(yīng)用的含氯除草劑和植物生長調(diào)節(jié)劑,2,4-D自然條件下不易生物分解,水中溶解度較高,易通過自然循環(huán)途徑進入生態(tài)系統(tǒng)[1-2].通常2,4-D作為除草劑用量可達(dá)500 mg/L,作為植物生長調(diào)節(jié)劑用量可達(dá)30 mg/L[3].2,4-D已被確認(rèn)為是一種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物,可在生物體內(nèi)積累并損傷組織器官,如腎臟、肝臟和腦組織,嚴(yán)重危害人體健康[2],因此不僅在我國水果和蔬菜中2,4-D的殘留量受到《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》(GB 2760—2011)[4]嚴(yán)格限值,而且在我國《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB 5749—2006)中明確規(guī)定2,4-D的質(zhì)量濃度限值為30 μg/L[5].對于低質(zhì)量濃度2,4-D的檢測,目前主要以色譜法為主,如液相色譜、氣相色譜、液質(zhì)聯(lián)用、氣質(zhì)聯(lián)用等[3-4,6-8],雖然靈敏度高,但儀器設(shè)備昂貴,操作繁瑣,且對技術(shù)人員素質(zhì)要求較高,難以實現(xiàn)批量大規(guī)模的快速檢測.隨著生物技術(shù)的發(fā)展,酶抑制、免疫分析和分子印跡方法測定技術(shù)逐步發(fā)展起來[5,9-12],特別是免疫分析技術(shù),將抗體或抗原作為特定的感測元件,通過檢測特定抗原-抗體在載體表面結(jié)合中的反應(yīng)[13-14],根據(jù)光電信號的變化,即可檢測2,4-D的質(zhì)量濃度.該方法具有特異性強、方便快捷、成本低等優(yōu)點,從而受到國內(nèi)外的廣泛關(guān)注[15-16].

珠三角地區(qū)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)達(dá),水網(wǎng)密布,在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中使用的農(nóng)藥極易進入河道水環(huán)境系統(tǒng)[17],而廣東省飲用水水源地多為地表水,在珠江主干流西江磨刀門水道附近的監(jiān)測結(jié)果表明,多種農(nóng)藥的質(zhì)量濃度在部分時段雖然未超出我國水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn),但已超出歐盟飲用水水質(zhì)中相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[18],存在較大的農(nóng)藥污染和安全風(fēng)險隱患,因此水環(huán)境中農(nóng)藥殘留濃度的監(jiān)測和預(yù)警對于保障飲用水水質(zhì)安全具有重要的意義.西江肇慶段水質(zhì)良好,一直是廣州、深圳、佛山等城市的重要優(yōu)質(zhì)河流型飲用水水源之一[19-20],為了實現(xiàn)對有機農(nóng)藥的在線預(yù)警,本文作者開展了以2,4-D為監(jiān)測對象,對在線免疫傳感器監(jiān)測進行了相關(guān)研究,為長期且連續(xù)實現(xiàn)西江肇慶段水質(zhì)有機農(nóng)藥預(yù)警提供參考.

1 材料和方法

1.1 2,4-D在線免疫傳感器系統(tǒng)

2,4-D在線免疫傳感器由北京金達(dá)清創(chuàng)環(huán)境科技有限公司提供[21],主要包括進樣系統(tǒng)、免疫芯片、激光器、多路信號采集與光電轉(zhuǎn)換系統(tǒng)、數(shù)據(jù)采集與處理單元共5部分組成.免疫熒光傳感芯片是基于免疫學(xué)反應(yīng)原理,采用硅烷化試劑加高分子聚合物對2,4-D免疫芯片進行修飾制備而成,對2,4-D特異性抗體有很強的特異性響應(yīng),通過檢測免疫傳感器的光電信號大小,可實現(xiàn)2,4-D的定量監(jiān)測[22-23].具體制備制作過程略.

1.2 主要試劑

主要試劑包括:2,4-D標(biāo)樣(100 μg/mL,北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司);質(zhì)量濃度0.5%的十二烷基硫酸鈉溶液(pH=1.9,廣州化學(xué)試劑廠);磷酸鹽緩沖溶液(pH=7.6,廣州化學(xué)試劑廠);去離子水(實驗室自制).

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

樣品測試之前,需要根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品確定其工作的信號強度—抗原質(zhì)量濃度關(guān)系曲線,即標(biāo)準(zhǔn)曲線.免疫檢測技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線可用Logistic模型模擬,即:

(1)

式中:Y為有效信號值;A1和A2分別為最大和最小效信號值;x為待測樣品中抗原質(zhì)量濃度(單位:μg/L);x0為半抑制質(zhì)量濃度(單位:μg/L);p為拐點處切線斜率.

在本實驗中,采用系列2,4-D標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量濃度:0.033,0.100,0.300,1.000,10.000,20.000,33.000,50.000,66.000,100.000,200.000,500.000 μg/L進行測試,測試步驟為:1) 去離子水清洗3次;2) 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量濃度樣品測定;3) 去離子水清洗3次,然后進入下一個樣品質(zhì)量濃度的測定,每個樣品質(zhì)量濃度測試一次的時間約為30 min,最終根據(jù)測定的結(jié)果,畫出Logistic擬合曲線,確定在線分析的有效測定范圍.

1.4 記憶效應(yīng)測試

考慮到實際水樣中2,4-D的質(zhì)量濃度在不斷發(fā)生變化,有可能出現(xiàn)高濃度沖擊負(fù)荷的情況,在含高濃度2,4-D的水樣與免疫芯片反應(yīng)后,有可能會影響后續(xù)的測定,需要考慮如何消除因沖擊負(fù)荷的影響而帶來的誤差;此外在緊急情況下,需要考慮對實際水樣每天進行多次分析,如何實現(xiàn)多次分析的測定結(jié)果準(zhǔn)確度等.因此針對上述問題開展了記憶效應(yīng)測試.即選取低標(biāo)(10 μg/L的2,4-D標(biāo)準(zhǔn)溶液)和高標(biāo)(100 μg/L的2,4-D標(biāo)準(zhǔn)溶液),模擬實際水樣測定中的高濃度沖擊負(fù)荷的影響(空白—高標(biāo)—空白),及多次分析測定的影響(低標(biāo)—高標(biāo)—低標(biāo)).間歇地將待測試樣品送至儀器,且讓儀器連續(xù)工作,每個樣品測定時間為6～8 min,測定完成后,馬上進行下一個樣品的測試,以模擬實際測定中儀器連續(xù)工作的信號響應(yīng)結(jié)果,分析其與實際值之間的差異.

1.5 比對實驗測試

為了進一步考察2,4-D在線免疫傳感器測試的穩(wěn)定性及可靠性,通過配置不同質(zhì)量濃度的2,4-D標(biāo)準(zhǔn)溶液(15.0,22.5,25.0,40.0,60.0,80.0 μg/L),共計48組,每組2個水樣,其中1個水樣進行2,4-D在線免疫傳感器的直接測定,另1個水樣送至具有質(zhì)量認(rèn)證資質(zhì)的某中心進行人工高效液相色譜方法的盲測,對比兩者以確定2,4-D在線免疫傳感器的性能.

1.6 西江水連續(xù)運行測試

在西江肇慶三榕峽水質(zhì)自動監(jiān)測站(西江肇慶段三榕水廠取水口上游300 m處),安裝2,4-D在線免疫傳感器,傳感器位于自動監(jiān)測站室內(nèi),西江水的待測水樣由位于西江河道中安裝的潛水泵抽取,潛水泵取樣點的平均水位為17.5 m,水流流速平均為1.7 m/s,經(jīng)潛水泵抽取的水樣通過27 m長的管道直接輸送至自動監(jiān)測站室內(nèi),配送至水樣儲備槽(體積約10 L),然后由2,4-D在線免疫傳感器的進水取樣器抽取水樣儲備槽中的西江水進行測定分析,以研究免疫傳感器的信號響應(yīng)及測定結(jié)果.2,4-D在線免疫傳感器運行方式為晚間每2 h測定一次,白天每0.5 h測定一次.

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線分析

2,4-D在線分析儀的Logistic曲線測定結(jié)果如圖1所示,可以看出Logistic曲線方程為:

(2)

圖1 2,4-D在線免疫傳感器的Logistic曲線測定結(jié)果

相關(guān)性系數(shù)R為0.9967,因此Logistic曲線方程能夠很好地描述免疫芯片抗原對2,4-D的響應(yīng)過程.系統(tǒng)對2,4-D的檢測限可達(dá)0.033 μg/L,但從定量響應(yīng)范圍看,在10 ～ 200 μg/L內(nèi)具有良好的半對數(shù)線性關(guān)系(y=-4166 lnx+26460),相關(guān)系數(shù)R達(dá)0.9915.因此2,4-D在線分析儀可實現(xiàn)在10 ～ 200 μg/L內(nèi)對2,4-D的精確測定,考慮到我國《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB 5749—2006)中2,4-D的質(zhì)量濃度限值為30 μg/L,采用2,4-D在線分析儀實現(xiàn)對水質(zhì)的預(yù)警監(jiān)測是可行的.

2.2 記憶效應(yīng)分析

圖2 2,4-D在線免疫傳感器的記憶效應(yīng)測試結(jié)果.(A)空白—高標(biāo)—空白;(B)低標(biāo)—高標(biāo)—低標(biāo)

不同條件下2,4-D在線分析儀的記憶效應(yīng)實驗結(jié)果如圖2所示,從圖2中可以看出,當(dāng)采用空白—高標(biāo)—空白模式時,2,4-D在線分析儀能夠?qū)崿F(xiàn)對2,4-D的信號精確響應(yīng),連續(xù)3次測定值分別為99.3,102.1和106.5 μg/L,與理論值100 μg/L吻合度高,3次測量的平均相對誤差為2.6%,用去離子水進行的連續(xù)空白測定結(jié)果平均值為3.8 μg/L;當(dāng)采用低標(biāo)—高標(biāo)—空白模式時,在線分析儀仍然能夠?qū)Ω邩?biāo)濃度實現(xiàn)較準(zhǔn)確的測定,3次測定值分別為98.3,108.0和109.1 μg/L,3次測量的平均相對誤差為5.2%,但隨后測定低標(biāo)10 μg/L樣品時,誤差較大,3次測定平均值為17.4 μg/L.因此可以認(rèn)為在線分析儀存在一定的記憶效應(yīng),需要在實際運行中多次沖洗熒光芯片,以減輕高濃度2,4-D測定對后續(xù)低濃度樣品的影響.

2.3 比對試驗結(jié)果分析

比對48組不同質(zhì)量濃度2,4-D的雙盲測定,即2,4-D在線分析儀與標(biāo)準(zhǔn)實驗室人工測定,結(jié)果如圖3所示.從圖3中可以看出,在2,4-D質(zhì)量濃度分別為15.0,22.5,25.0,40.0 μg/L的條件下,在線分析儀能夠?qū)崿F(xiàn)穩(wěn)定準(zhǔn)確的測定,平均相對誤差為4.0%;而標(biāo)準(zhǔn)實驗室人工測定值的平均相對誤差為13.0%;當(dāng)2,4-D質(zhì)量濃度分別為60,80 μg/L的條件下,在線分析儀測定值的平均相對誤差為12.0%,而人工測定值的相對誤差為5.6%.48組樣品的整體平均相對誤差,在線分析儀為6.6%,而人工測定為11.0%.特別是在2,4-D質(zhì)量濃度為15和80 μg/L時,人工測定出現(xiàn)了多次重大的偏差,盲測的水樣中2,4-D質(zhì)量濃度測定結(jié)果為0.分析原因除了人工多次測定誤差外,也有可能是由于取樣再送至實驗室進行人工測試,過程繁瑣且耗時長,存在樣品瓶泄漏或者污染等因素.不管怎樣,在多次大量數(shù)據(jù)分析測定中,雖然在線分析儀存在誤差,甚至相對高的誤差,但人工測定引起的誤差則有可能會大大高于儀器,因此開發(fā)水質(zhì)在線監(jiān)測分析儀器對于實現(xiàn)水環(huán)境質(zhì)量的安全預(yù)警,具有重要意義.對于2,4-D在線分析儀連續(xù)多次存在的誤差,可能來源于芯片的記憶效應(yīng)干擾,也可能是芯片的穩(wěn)定性仍有待于進一步提高.

圖3 2,4-D不同測定方法的比對實驗結(jié)果

2.4 西江水實際運行結(jié)果分析

西江肇慶三榕峽水質(zhì)自動監(jiān)測站處水質(zhì)優(yōu)良,達(dá)到地表水II類標(biāo)準(zhǔn),長期的人工監(jiān)測分析表明,水中農(nóng)藥類物質(zhì)質(zhì)量濃度極低,其中2,4-D的質(zhì)量濃度在該處遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于國家標(biāo)準(zhǔn),一直在檢測線以下.在該監(jiān)測站進行了為期2個月的連續(xù)運行(2018年4月1日—5月31日),2,4-D在線免疫傳感器系統(tǒng)獲得的2,4-D質(zhì)量濃度在其檢測限以下,儀器顯示值為0,與實際情況相符,未出現(xiàn)系統(tǒng)報警現(xiàn)象.

綜合上述結(jié)果,2,4-D在線免疫傳感器能夠?qū)崿F(xiàn)對水環(huán)境中2,4-D的大量快速檢測,有望在實際應(yīng)用中推廣,實現(xiàn)水環(huán)境質(zhì)量預(yù)警監(jiān)測的作用.

3 結(jié) 語

2,4-D在線免疫傳感器對2,4-D濃度的響應(yīng)符合Logistic曲線方程,在10～200 μg/L的2,4-D濃度范圍內(nèi),在線免疫傳感器的信號響應(yīng)可符合半對數(shù)線性方程.免疫芯片存在一定的記憶效應(yīng).48組測定比對實驗表明,在線免疫傳感器的測定誤差小于人工測定誤差,2,4-D在線免疫傳感器可用于西江水的監(jiān)測,運行穩(wěn)定,信號可靠,為實現(xiàn)水環(huán)境有毒有害有機物的在線監(jiān)測預(yù)警提供了一種新的技術(shù)解決方案.