熊果酸標準樣品的研制

王岱杰，于金倩，崔莉，付瑞明，宋祥云，耿巖玲

（山東省分析測試中心，山東省中藥質(zhì)量控制技術(shù)重點實驗室，山東濟南250014）

熊果酸（ursolic acid），又名烏索酸，是廣泛存在于天然植物中的一種五環(huán)三萜類化合物（結(jié)構(gòu)見圖1），現(xiàn)代藥理研究表明，熊果酸具有抗氧化、抗炎、抑菌、抗病毒、保肝、抗抑郁、降低大腦氧化損傷、治療糖尿病和殺蟲等多種特性[1-15]，同時對肺癌、肝癌、胰腺癌、乳腺癌等多種癌癥細胞模型具有良好的抑制效果[16-23]。熊果酸是《藥典》規(guī)定的山楂、木瓜、烏梅、山茱萸和大葉紫珠等12味藥材及相關(guān)復方的鑒別和質(zhì)量控制指標[24]，同時山楂、木瓜、烏梅和山茱萸都是藥食同源或可用于保健食品的植物，目前市場上熊果酸樣品主要以對照品為主，純度參差不齊，未按照國家標準進行均勻性、穩(wěn)定性和定值試驗，最終結(jié)果沒有不確定度評價，樣品也不具有溯源性，制約了各類以山楂、木瓜、烏梅和山茱萸等為原料的中藥、食品、保健品等產(chǎn)品的質(zhì)量控制，因而亟需標準化的熊果酸標準樣品。

標準樣品是具有一種或多種足夠均勻的和很好確定了特性值的材料或物質(zhì)，可以用來校準儀器、評價測量方法和給材料賦值[25]。隨著天然產(chǎn)物包括中藥材市場國際化的發(fā)展，研制與國際標準化組織（International Organization for Standardization，ISO）對接的標準樣品的需求愈發(fā)迫切，也是國內(nèi)外研究的熱點。目前，我國研發(fā)的天然產(chǎn)物標準樣品種類和數(shù)量嚴重不足，影響相關(guān)產(chǎn)品的檢測，也制約了相關(guān)行業(yè)的發(fā)展。為改善這一現(xiàn)狀，我國天然產(chǎn)物標準樣品的研究正在廣泛開展[26]。因此，為了滿足熊果酸及相關(guān)產(chǎn)品的檢測需求，保證檢測結(jié)果的準確性、可比性和溯源性，本文參照ISO導則35和GB/T 15000.3-2008《標準樣品工作導則（3）標準樣品定值的一般原則和統(tǒng)計方法》[27]，以薔薇科植物山楂（Crataegus pinnatifida Bge.）的干燥成熟果實為原料，成功研制了熊果酸國家標準樣品。

圖1 熊果酸化學結(jié)構(gòu)式Fig.1 The chemical structure of ursolic acid

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

NKA型大孔樹脂：滄州寶恩吸附材料科技有限公司；柱層析硅膠、GF254薄層硅膠板：青島海洋化工廠；高效液相色譜用甲醇（色譜純）：美國天地公司；水為重蒸水；其它試劑為分析純；山楂藥材：濟南建聯(lián)中藥店，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學李佳教授鑒定為薔薇科植物山楂的干燥成熟果實，樣本存放于山東省分析測試中心。

1.2 儀器與設(shè)備

R-3型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：瑞士BUCHI公司；SCIENTZ-10N型冷凍干燥儀：寧波新芝生物科技股份有限公司；E2695型高效液相色譜儀：美國waters公司；ZF-I型三用紫外分析儀：上海顧村電光儀器廠；TH-II型薄層加熱器：上海科哲生化科技有限公司；WRS-1B型數(shù)字熔點儀：上海精密科學儀器有限公司；UV-2550型紫外可見分光光度計：日本島津公司；INOVA 600 MHz核磁共振波譜儀：美國瓦里安公司；6520 Q-ToF型液質(zhì)聯(lián)用儀：美國安捷倫公司；STA 449FC型同步熱分析儀：德國耐馳公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

取山楂藥材5 kg粉碎，用95%乙醇回流提取3次，每次2 h，抽濾，合并濾液，減壓濃縮至無醇味，等體積石油醚脫脂3次，水溶液進行NKA大孔樹脂富集，分別用純水、25%乙醇、50%乙醇、85%乙醇、95%乙醇洗脫，85%乙醇洗脫部分濃縮，冷凍干燥，得熊果酸粗品。將熊果酸粗品經(jīng)硅膠柱色譜反復分離，石油醚/乙酸乙酯梯度洗脫，收集含熊果酸組分。薄層色譜跟蹤監(jiān)測，石油醚∶乙酸乙酯（4∶1，體積比）為展開劑。將收集到的相同部分放置在通風櫥內(nèi)，乙醇重結(jié)晶，過濾并干燥。

1.3.2 純度分析方法

1.3.2.1 高效液相色譜分析

等度條件：shim-pack C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為甲醇-0.2%乙酸水溶液（91∶9，體積比）；流速：0.6 mL/min；柱溫：30 ℃；運行時間：35 min；檢測波長：210nm；樣品濃度0.2mg/mL，甲醇溶解。梯度條件：YMC C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：A 為甲醇，B 為 0.2%乙酸水溶液；0～25 min，91%A，25 min～45 min，91%A～100%A，45 min～55 min，100%A。流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；運行時間：55 min；檢測波長：210 nm，樣品同上。

1.3.2.2 薄層鑒別

精密稱取樣品5mg，加甲醇配制成濃度為0.2 mg/mL對照品溶液。展開劑分別為氯仿-甲醇（100∶1，體積比）和石油醚-乙酸乙酯（4∶1，體積比），定量毛細點樣管吸取 20、40、60、80、100 μg，梯度將樣品點于 GF254硅膠板。兩種展開劑分別展開，取出，晾干，分別用10%硫酸乙醇法顯色，105℃下加熱3 min，至斑點顯色清晰。

1.3.2.3 高效液相色譜-質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）純度分析

分析條件：shim-pack C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為甲醇/0.2%乙酸水溶液（91∶9，體積比）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；運行時間：30 min。MS條件：ESI電噴霧離子源，毛細管電壓為4.0 kV，載氣為載氣，載氣流速為10 L/min，載氣溫度為300℃，掃描范圍 m/z 100～1 000。

1.3.2.4 熱重分析

精密稱取樣品5 mg，置于熱重用坩堝中，熱重條件：初溫30℃，最終溫度600℃，升溫速率10℃/min，氣體 N2，流量 100 mL/min。

1.3.3 結(jié)構(gòu)表征

熊果酸單體的結(jié)構(gòu)表征采用紫外光譜、紅外光譜、質(zhì)譜和核磁共振等技術(shù)。紫外光譜法的測試溶劑為甲醇，掃描范圍為200 nm～400 nm；紅外光譜法采用KBr壓片，掃描波數(shù)為 400 cm-1～4 000 cm-1；質(zhì)譜為電噴霧離子源，載氣溫度為300℃，載氣流速為10 L/min，載氣為載氣，毛細管電壓為4.0 kV，掃描范圍m/z為100～1 000；核磁共振法的氘代試劑為DMSO-d6。

1.3.4 均勻性檢驗

依據(jù)標準樣品導則（均勻性研究）要求[27]，采用順序重復隨機測量，隨機抽取分裝好的熊果酸樣品10瓶，3種抽樣程序（第1種1-3-5-7-9-2-4-6-8-10；第 2種 10-9-8-7-6-5-4-3-2-1；第 3 種 2-4-6-8-10-1-3-5-7-9），樣品按1.3.2中規(guī)定純度方法進行分析，樣品純度讀取采用峰面積歸一化法，采用方差分析法進行數(shù)據(jù)分析。

1.3.5 穩(wěn)定性檢驗

熊果酸樣品儲存溫度為0℃～4℃，考察樣品的2年穩(wěn)定期，分5個時間段考察監(jiān)測，按1.3.2中規(guī)定純度方法進行分析，樣品純度讀取采用峰面積歸一化法，每份樣品測定5次，統(tǒng)計分析采用t檢驗法[28]。

1.3.6 定值

根據(jù)工作導則，標準樣品的定值采用8家實驗室協(xié)作進行的方法。隨機抽取樣品24瓶，每家定值實驗室寄出樣品3瓶，每瓶測定2次，協(xié)作實驗室共出6個檢測結(jié)果，樣品純度以峰面積歸一化法讀取[27-28]。

2 結(jié)果與分析

2.1 純度分析

采用HPLC的二極管陣列檢測器對色譜峰進行3D總吸收圖掃描，檢測結(jié)果扣除溶劑峰，HPLC純度分析結(jié)果見圖2、圖3和圖4。

圖2 熊果酸等度洗脫HPLC圖譜Fig.2 HPLC chromatogram of ursolic acid by socratic elution

圖3 熊果酸梯度洗脫HPLC圖譜Fig.3 HPLC chromatogram by gradient elution

圖4 熊果酸HPLC 3D掃描圖Fig.4 Three dimensional chromatogram of ursolic acid by HPLC

由圖2～圖4可知，未見明顯雜質(zhì)峰存在，樣品純度良好。以氯仿-甲醇（100∶1，體積比）和石油醚-乙酸乙酯（4∶1，體積比）為展開劑進行薄層色譜檢測，10%硫酸乙醇顯色。薄層結(jié)果表明，樣品呈現(xiàn)紫紅色斑點，Rf值分別為0.51和0.49，未見明顯雜質(zhì)斑點存在。

HPLC-MS的檢測結(jié)果見圖5。

圖5 熊果酸樣品的液質(zhì)譜總離子流圖Fig.5 Total ionic chromatogram of ursolic acid by HPLC-MS

由圖5可知，未見明顯的雜質(zhì)峰存在。

熱重分析的結(jié)果見圖6。

圖6 熊果酸的熱重圖Fig.6 The thermogravimetric curve of ursolic acid

由圖6可知，在25℃～189℃溫度范圍內(nèi)，熱重分析曲線是一條水平線，表明測試樣品中吸附水和結(jié)晶水含量很低，熱穩(wěn)定性好。當溫度增加超過189℃時，樣品開始分解，差熱分析法（differential thermal analysis，DTA）曲線顯示溫度升高到261.5℃，樣品迅速分解。

2.2 結(jié)構(gòu)表征

2.3 均勻性檢驗

將結(jié)果進行F檢驗，進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，確定熊果酸樣品的均勻性，結(jié)果見表1和表2。

表1 均勻性檢驗數(shù)據(jù)Table 1 Results of homogeneity test %

表2 方差分析數(shù)據(jù)Table 2 Results of variance analysis

瓶間方差的計算公式：

則瓶間標準偏差為：

F值的計算公式：

以組間自由度υ1=9及組內(nèi)自由度υ2=20為變量查詢F界值表，可知臨界值F0.05（9，20）=2.94，由于F＜F0.05（9，20），因此所研制的熊果酸標準樣品具有良好的均勻性。

2.4 穩(wěn)定性檢驗

采用t檢驗法對穩(wěn)定性檢測結(jié)果統(tǒng)計分析，采用直線模型，觀察直線斜率值變化趨勢，同時進行預測，結(jié)果見表3。

表3 穩(wěn)定性檢驗數(shù)據(jù)Table 3 Result of stability test %

斜率計算公式如下：

式中：y=99.79；x=12。

截距計算公式如下：

直線模型的標準偏差：

則s=0.03

斜率相關(guān)不確定度計算公式如下：

查表得自由度為n-2和95%置信水平（p=0.95）分布的t因子為3.182。

由于斜率變化的絕對值|b1|＜t0.95，n-2·s（b1）=3.182×0.002=0.009 5，

即：|b1|＜0.009 5。

因此，斜率變化不顯著，即熊果酸標準樣品在兩年內(nèi)穩(wěn)定性良好。

穩(wěn)定性的不確定度為：

u穩(wěn)=Sb×t=0.003×24=0.08

2.5 定值

根據(jù)各個協(xié)作實驗室的反饋結(jié)果，進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，并最終確定熊果酸標準樣品的標準值和不確定度，統(tǒng)計結(jié)果如表4。

表4 協(xié)作定值數(shù)據(jù)Table 4 Results of purity value results %

測定結(jié)果總平均值的計算公式如下：

實驗室平均值的標準偏差為：

總平均值標準偏差為：

多家定值引入的不確定度

熊果酸標準樣品的不確定度由如下3部分組分：（1）均勻性檢驗不確定度；（2）穩(wěn)定性檢驗不確定度；（3）定值不確定度，這3部分不確定度分量互不相關(guān)，需將3種不確定度合成，即合成不確定度（U合成）為：

代入數(shù)據(jù)計算得U合成=0.09%

置信區(qū)間95%時，k=2

則熊果酸標準樣品的擴展不確定度：

3 結(jié)論

本研究針對熊果酸及相關(guān)產(chǎn)品缺乏國家標準樣品的現(xiàn)狀，嚴格按照國標規(guī)定的標樣樣品研制規(guī)則，成功的研制出熊果酸標準樣品，并順利通過了專家驗收。研制過程中對標準樣品的均勻性進行考察，并進行方差分析；穩(wěn)定性檢驗采用直線模型，并進行了t檢驗法考察；定值采用多家實驗室協(xié)作，對定值結(jié)果進行統(tǒng)計分析。根據(jù)3個方面引入的不確定度，進行了不確定度的合成和擴展，獲得了標準值為99.80%，置信度95%的不確定度為0.18%的熊果酸國家標準樣品，具有樣品溯源性，可用于相關(guān)產(chǎn)品的檢測方法評定和含量測定，填補了熊果酸標準樣品的國內(nèi)外空白。