茶葉兒茶素及咖啡堿檢測方法中提取條件研究

涂云飛

（1.浙江省茶資源跨界應(yīng)用技術(shù)重點實驗室，浙江杭州310016；2.中華全國供銷合作總社杭州茶葉研究院，浙江杭州310016）

兒茶素是以2-苯基苯并吡喃為主體結(jié)構(gòu)的黃烷醇類化合物，一般包括表型兒茶素（epicatechin，EC）、表沒食子型兒茶素（epigallocatechin，EGC）、表兒茶素沒食子酸酯（epicatechin gallate，ECG）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG），其總質(zhì)量份數(shù)在干茶中一般高于7%（質(zhì)量分數(shù)）。兒茶素具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗腫瘤等特性[1-17]，是茶葉重要的風(fēng)味與保健因子。

茶葉中兒茶素及咖啡堿可以通過丙酮、乙醇、甲醇、乙腈或水等為溶劑在一定溫度與時間參數(shù)條件下提取出來。利用純水在80℃提取20 min，可將97%的兒茶素提取出，提高溫度至95℃提取10 min，能夠獲得90%的提取率，但高溫長時間可使兒茶素類成分降解[18]與異構(gòu)化[19-21]。茶兒茶素的提取還受到pH的影響，隨其值增加，茶四種主要兒茶素破壞也增加[22]，即茶兒茶素在堿性條件下極其不穩(wěn)定，降低pH至4以下會使其更加穩(wěn)定，同時維生素C能夠在中性溶液中顯著增加兒茶素結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[23]。另有研究采用70%甲醇溶液3次提取，并用水定容到50 mL[24]或0.1 g樣品加入體積分數(shù)為50%的甲醇水溶液10 mL，置于超聲波中超聲提取40 min[25]均可作為茶兒茶素有效檢測的前處理提取方法。

同時，綠茶中咖啡堿的含量在2%～5%（質(zhì)量分數(shù)）左右，具有興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)，促進胃酸分泌、治療偏頭痛[26]，但不適宜易失眠者、小孩、孕婦以及老人飲用。故準(zhǔn)確的定量這兩類成分為衡量茶葉品質(zhì)、指導(dǎo)綠茶加工等領(lǐng)域的應(yīng)用作出重要的技術(shù)保障。國際、國家執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)[Determination of substances characteristic of green and black tea-Part 2：Content of catechins in green tea-Method using high-performance liquid chromatography（ISO14502-2005E），茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法（GB/T 8313-2008）][27-28]已經(jīng)給出了茶葉中4種表型兒茶素及（+）-兒茶素的高效液相色譜的檢測方法，并以70%甲醇作為溶劑提取茶葉中的茶兒茶素，茶兒茶素可以看作茶葉品質(zhì)等級的重要指標(biāo)。現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)GB/T 8313-2008中，甲醇作為兒茶素及咖啡堿的提取試劑具有較高的揮發(fā)性和毒性，尋找安全低毒類試劑作為提取試劑具有一定的意義。筆者將茶有效成分提取工藝生產(chǎn)中廣泛采用的水和乙醇，引入到茶葉兒茶素及咖啡堿的定量提取當(dāng)中，并考察優(yōu)化了提取參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

JB/T5374型電子分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；HH-6型水浴鍋：常州朗越儀器制造有限公司；TDZ4A-WS離心機：湖南賽特湘儀離心機儀器有限公司；Waters高效液相色譜儀（1525泵、2487紫外可見雙通道檢測器、717-plus自動進樣器、Breeze控制軟件包，色譜柱為Phenomenex Luna Phenyl-Hexyl，250mm×4.6mm，5μm，柱溫為35℃，檢測波長為278nm，進樣量10 μL）：沃特世科技（上海）有限公司。

1.2 試劑

乙醇（分析純，純度≥99.7%）：浙江三鷹化學(xué)試劑有限公司；乙腈、冰醋酸、甲醇（分析純，純度≥99.5%）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；純凈水：浙江省茶資源跨界應(yīng)用技術(shù)重點實驗室自制。

1.3 茶樣

選用兩只粉碎60目以上的綠茶樣（綠茶1號樣和2號樣為浙江省茶資源跨界應(yīng)用技術(shù)重點實驗室自制）作為實驗對象，并以國標(biāo)（GB/T 8313-2008）方法對兩只綠茶樣中的沒食子酸（GA）、表沒食子兒茶素（EGC）、兒茶素（（+）-C）、咖啡堿（CAF）、表兒茶素（EC）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）作了測定，見圖1。

具體結(jié)果為：綠茶1號和2號樣中GA、EGC、（+）-C、CAF、EC、EGCG、ECG 質(zhì)量百分含量（%，質(zhì)量分數(shù)）分別為 0.07、0.28、0.13、2.96、0.60、8.82、2.32；0.14、0.56、0.07、4.29、0.26、9.03、3.04。

1.4 正交試驗設(shè)計

準(zhǔn)確稱取0.2 g茶樣至100 mL提取三角瓶中，加入30 mL溶劑，振蕩提取一定時間后，3 000 r/min心10 min，上清轉(zhuǎn)入50 mL容量瓶中，待冷卻至室溫用去離子水定容至刻度，搖勻備用。并以乙醇濃度、提取溫度、提取時間作了三因素三水平優(yōu)化試驗，具體試驗安排如表1所示。

圖1 沒食子酸、咖啡堿及兒茶素測定色譜圖Fig.1 HPLC spectrum of GA，caffeine and catechins

表1 三因素三水平正交試驗安排表Table 1Factors and levels of L9（33）orthogonal design

2 結(jié)果與討論

2.1L9（33）正交試驗結(jié)果與方差分析

正交試驗各因素極差值可直觀判斷其對茶葉中被檢成分提取時的影響程度，即因素對試驗無影響時，因素各水平對應(yīng)的k值應(yīng)相等。L9（33）正交試驗結(jié)果與方差分析見表2。

表2 三因素三水平正交試驗結(jié)果與方差分析Table 2Results of extraction method L9（33）orthogonal design and variance analysis

由表2極差分析可知，3個因素對 GA、EGC、（+）-C的影響較為顯著，極差值占k值的10%以上。提取時間與提取溫度對EC無影響，對CAF、EGCG及ECG的影響較小；乙醇濃度對CAF的影響較小，但對EGCG和ECG達到了顯著水平，即隨著乙醇濃度的增加，EGCG和ECG在提取液中的濃度亦隨之加大。GA、EGC、（+）-C由于本身在茶葉中的含量相對較低，雖然各因素有影響，但是不同水平條件下均可較充分的提取出來。

續(xù)表2 三因素三水平正交試驗結(jié)果與方差分析Continue table 2Results of extraction method L9（33）orthogonal design and variance analysis

為辨別因素與試驗誤差對各成分檢測試驗數(shù)據(jù)波動的貢獻程度，試驗進一步對結(jié)果進行了方差分析檢驗，并將各因素的方差小于2倍誤差方差合并至誤差項，以提高F檢驗的靈敏度。結(jié)果表明，（1）在0.05置信水平，提取溫度對GA達到極顯著水平，對EGC達到顯著水平，乙醇濃度對CAF達到顯著水平；（2）在0.01置信水平，乙醇濃度對EC、EGCG、ECG達到極顯著水平，提取溫度對EC的影響達到極顯著水平，對EGCG達到顯著水平。而各因素對GA、（+）-C的影響，方差分析未達到顯著水平。

進一步分析發(fā)現(xiàn)，100℃會造成酯型兒茶素類成分發(fā)生部分降解，適度的溫度有利于兒茶素類成分的提取和穩(wěn)定。極顯著因素乙醇20%濃度在70℃條件下，GA、EGC、（+）-C、CAF 及 EC 在 10 min～30 min 均得到了充分提取；而酯型兒茶素EGCG和ECG相比于國標(biāo)方法（GB/T 8313-2008），約有百分之十幾的含量未被提取出來。

2.2 單因素乙醇濃度對酯型兒茶素浸出影響

試驗在2.1的基礎(chǔ)上，增加了乙醇濃度，考察了乙醇濃度對酯型兒茶素的浸出情況見圖2。

圖2表明，當(dāng)濃度提高至25%及30%時，酯型兒茶素在10 min～30 min能完全提取浸出，即，1號樣與2號樣酯型兒茶素EGCG的浸出率分別為96.64%～100.01%和100.00%～132.51%；ECG的浸出率分別是國標(biāo)方法的96.36%～100.95%和97.85%～104.36%。因此在一定溫度的前提下，濃度與浸出高度相關(guān)，但過高的濃度會提高酯溶性成分的浸出，增加色譜柱污染程度，因此，在充分提取各成分條件前提下，乙醇濃度25%～30%適合作為茶葉中兒茶素及咖啡堿定量的提取溶劑。

圖2 乙醇濃度及提取時間對酯型兒茶素提取的影響Fig.2 Influence of ethanol concentration and infusion time factors on galloyl catechins leaching rate

3 結(jié)論

本文將安全低毒類試劑乙醇水溶液引入到茶葉兒茶素及咖啡堿的定量提取當(dāng)中，并考察優(yōu)化了提取參數(shù)。在正交試驗各因素水平范圍內(nèi)，GA、EGC、（+）-C、CAF及EC能充分提取，但酯型兒茶素未能充分提取。3個因素當(dāng)中，發(fā)現(xiàn)乙醇濃度對EGCG和ECG的提取率均達到極顯著水平，因此，筆者進一步在單因素的基礎(chǔ)上將其當(dāng)濃度提高至25%及30%兩個濃度時，各茶樣的酯型兒茶素在10 min～30 min能完全提取浸出。為避免過高乙醇濃度增加茶酯溶性成分的溶出，控制乙醇濃度在水中的濃度范圍25%～30%時，固液比 1∶250（g/mL）、70℃的水浴和 10 min～30 min的提取時間能夠滿足茶葉中兒茶素及咖啡堿的定量提取分析。