板栗殼多酚的提取及其抗氧化性能的研究

王敏，田珍燕，王蔚新

（黃岡師范學院生命科學學院，大別山特色資源開發湖北省協同創新中心，湖北省經濟林木種質改良重點實驗室，湖北黃州 438000）

板栗屬殼斗科栗屬堅果類植物，為落葉喬木。板栗果肉的開發利用一直受到廣泛關注，作為加工廢棄物——板栗殼，還沒有得到有效地開發和利用。從板栗殼中提取出來的色素，是一種水溶性好、著色力強、性質穩定的天然棕色素[1]。其主要活性成分為多酚類化合物，有一定的抗氧化和抑菌等作用，廣泛用于食品、日用化學用品和藥品等產品的生產。

植物多酚類化合物的傳統提取溶劑多為乙醇、酸、堿等，但這些溶劑成本高、污染性強，且有殘留風險。采用水作為提取溶劑，具有廉價、環保、更適合工業生產的優點。超聲波能促進植物細胞內的可溶性物質快速溶解到溶劑中，可用于各種植物活性成分的輔助提取，具有耗時短、得率高、消耗溶劑少等特點。蔣孟君等[2]采用超聲波輔助提取可食用玫瑰花多酚，總多酚含量達到93.81 mg/g，效果顯著。植物多酚抗腫瘤、抗衰老等生理活性與其具有的清除自由基和抗氧化能力密切相關[3]。馬承慧等[4]究了松針多酚對DPPH·和·OH兩種自由基的清除效果，結果表明其具有較好的抗氧化能力。目前板栗總苞、種皮中含有的多酚物質已有一定研究，如石恩慧等[5]研究了板栗總苞多酚的抗氧化性，匙丹丹[6]研究了板栗種皮提取、純化和相關性質。但板栗殼（中果皮）中多酚相關研究相對較少，不足以為板栗殼的相關研究提供更加完整的理論依據。本研究采用超聲波輔助水提法提取板栗殼多酚物質，并通過測定板栗殼多酚提取液總抗氧化能力及其對5種不同抗氧化體系的清除效果，研究其抗氧化活性，旨在為板栗殼多酚的開發利用提供科學依據，同時實現變廢為寶，進一步促進板栗產業的發展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

板栗：黃岡市黃商集團購物中心。

福林酚試劑（生化試劑）：合肥博美生物；沒食子酸（分析純）：天津市大茂化學試劑廠；大孔樹脂（AB-8型）：陜西樂博生化科技有限公司；無水乙醇（分析純）：天津市北聯精細化學品開發有限公司；無水碳酸鈉（分析純）：天津市恒興化學試劑制造有限公司；鹽酸（分析純）：中平能化集團開封東大化工有限公司；鐵氰化鉀（分析純）：CANSPEC CHINA；維生素C（分析純）：天津市天力化學試劑有限公司等。

1.2 儀器與設備

UV-2600紫外可見分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司；SB25-12DTDN型超聲波清洗機：寧波新芝生物科技股份有限公司；普通玻璃層析柱（2.0 cm×45 cm）：陜西樂博生化科技有限公司等。

1.3 方法

1.3.1 多酚標準曲線的建立

稱取0.250 g沒食子酸，用水溶解定容至50 mL，分別取母液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 mL于50 mL容量瓶中稀釋成不同濃度梯度的備用液。分別從上述備用液中取0.2 mL置于10 mL容量瓶中，再分別加入0.5 mL福林酚混勻，30 s之后加入1.5 mL 20%碳酸鈉溶液，混勻、定容、暗處放置2 h后760 nm處測吸光度。

1.3.2 總多酚的測定及提取率計算

取10 g板栗殼粉按料液比1∶30（g/mL）添加甲醇于500 mL圓底燒瓶中，70℃水浴回流1 h。過濾取濾液同上利用福林酚試劑法測吸光度（以沒食子酸計）。根據回歸方程計算提取率：

多酚提取率（按沒食子酸計）（mg/g）=（[C×V/M）/1 000]×100%

式中：C為多酚質量濃度，μg/mL；V為多酚提取液總體積，mL；M為板栗殼粉質量，g。

1.3.3 板栗殼多酚粗提液的制備工藝流程

板栗殼→去雜、清洗、烘干→粉碎→加水超聲波提取→過濾取濾液→測吸光度→計算提取率（以沒食子酸計）

1.3.4 多酚提取工藝優化

分別研究料液比、超聲時間、超聲功率、超聲溫度這4個因素對板栗殼多酚提取率的影響。料液比取1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50（g/mL）；超聲時間取 0.5、1.0、1.5、2.0 h；超聲功率取 200、300、400、500 W；超聲溫度取 35、50、65、80 ℃。

1.4 大孔吸附樹脂分離純化板栗殼多酚的工藝流程

新樹脂先用95%乙醇浸泡24 h至充分溶脹后，裝柱，用去離子水洗至無醇味殘留[7]。將100 mL板栗殼多酚粗提液以2 BV/h過柱，以10 mL每管收集，以去離子水作為參比液，依次在380 nm條件下測定吸光度，達到泄漏點（多酚濃度為初始的1/10）時停止加樣，水洗未吸附殘液至流出液為無色，用紫環反應檢測洗脫終點，最后用100 mL 50%乙醇溶液以2 BV/h過柱洗脫至無色。

1.5 板栗殼多酚的抗氧化性測定

1.5.1 總抗氧化能力的測定

分別取 1.00 mL 不同質量濃度（30、60、90、120、150 μg/mL）的樣品溶液與系列同等質量濃度的VC溶液置于試管中，再加入0.2 mol/L、pH值＝6.6磷酸鈉緩沖液和1%鐵氰化鉀溶液各2.5 mL，在50℃水浴中放置20min后，加入2.5mL質量分數為10%的三氯乙酸，取混合液5mL并加入4 mL去離子水和1.0 mL、0.1%氯化鐵溶液，混合均勻，在700 nm下測定其吸光度A（以VC作為對照品）。吸光度越高，則總抗氧化能力越強[8]。

1.5.2 DPPH·清除率測定

參考朱潔等[10]的方法，并作適當修改。分別取2.0 mL 不同質量濃度（5、10、15、20、25、30、60、90、120、150 μg/mL）的樣品溶液與系列同等質量濃度的VC溶液，再分別加入等量0.057 mg/mL用無水乙醇配制的DPPH溶液，搖勻反應30 min，在517 nm下測定吸光度為A1。用體積分數為50%的乙醇溶液代替樣品液測定吸光度A0，用無水乙醇代替DPPH溶液測定吸光度A2。DPPH·清除率的計算見公式：

1.5.3 O2-·清除率測定

參考李霄等[9]的方法，并作適當修改。各個試管分別吸取50 mmol/L、pH=8.2的Tris-HCI緩沖液4.5 mL，在25℃水浴中放置20 min后，再分別加入1.0 mL不同質量濃度（10、20、30、60、90、120、150 μg/mL）的樣品溶液與系列同等質量濃度的VC溶液，然后加入0.4 mL、25.0 mmol/L的鄰苯三酚溶液，混勻后在25℃水浴中放置5 min，最后加入終止反應液1.0 mL、8.0 mol/L的HCl溶液，在波長為325 nm處測定吸光度A1。用雙蒸水代替樣品液測定吸光度A0。按下式計算清除率：

1.5.4 ABTS+·清除率測定

參考范金波等[11]的方法，并作適當修改。取適量體積7 mmol/L的ABTS溶液和等體積2.4 mmol/L的過硫酸鉀溶液，混合均勻后室溫避光放置12 h～16 h，形成ABTS+·母液備用。然后在734 nm波長處，將ABTS+·母液用10 mm/L、pH7.4的磷酸鹽緩沖溶液稀釋至吸光度為0.70±0.002，記作A0。分別取60 μL不同質量濃度（30、60、90、120、150 μg/mL）的樣品溶液與系列同等質量濃度的VC溶液，再分別加入6.0 mL ABTS+·母液，搖勻后室溫避光放置10 min，在波長為734 nm處測定吸光度為A1。用蒸餾水代替ABTS+·母液測定吸光度為A2。 ABTS+·清除率的計算同公式（1）。

1.5.5 NaNO2清除率測定

參考朱潔等[10]的方法，并作適當修改。分別取2.0mL不同質量濃度（30、60、90、120、150 μg/mL）的樣品溶液與系列同等質量濃度的VC溶液，再分別加入1.0 mL、5 μg/mL亞硝酸鈉溶液，搖勻后于37℃水浴30 min，取出立即加入1.0 mL、0.4%對氨基苯磺酸溶液，充分混勻后室溫放置15 min，再依次加入500 μL、0.2%鹽酸萘乙二胺溶液，混合均勻后靜置顯色15 min，在536 nm波長處測定吸光度A1。用50%乙醇代替樣品測定吸光度為A0，用蒸餾水代替鹽酸萘乙二胺溶液測定吸光度A2。亞硝酸基清除率的計算同公式（1）。

1.5.6·OH清除率測定

參考馬承慧等[4]的方法，并作適當修改。分別取1.0 mL 不同質量濃度（30、60、90、120、150 μg/mL）的樣品溶液與同等質量濃度的VC溶液，再分別加入1 mL、1 mmol/L硫酸亞鐵溶液和等體積1 mmol/L的過氧化氫溶液，以及2 mL、3 mmol/L鄰羥基苯甲酸溶液，搖勻后于37℃水浴30 min，在510 nm處測定吸光度A1。用蒸餾水代替鄰羥基苯甲酸測定吸光度A2，用蒸餾水代替樣品溶液測定吸光度A0。羥自由基清除率的計算同公式（1）。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

以沒食子酸標準品的濃度為橫坐標，以760 nm波長處的吸光度A為縱坐標（Y），繪制標準曲線，如圖1。

圖1 沒食子酸標準曲線Fig.1 Standard curve of gallic acid

回歸方程為：y=0.002 2x+0.022 5，R2=0.996 7。依據標準曲線，得到沒食子酸在質量濃度為50 μg/mL～500 μg/mL區間內具有良好的線性關系。

2.2 總多酚測定及提取率計算

由吸光度的平均值計算可知：板栗殼粉總多酚含量為16.6 mg/g板栗殼粉，用于計算板栗殼多酚的提取率。

2.3 超聲波提取單因素試驗

2.3.1 料液比對多酚提取率的影響

以料液比為橫坐標，以板栗殼多酚提取率為縱坐標，考察料液比對多酚提取率的影響，如圖2。

由圖2可知，隨著料液比的增大，板栗殼多酚提取率逐漸增大，但從1∶40（g/mL）處增長開始變緩慢，由此設定1∶40（g/mL）為較優料液比。出現該現象的原因可能是當板栗殼的量一定時，增加水的量可以降低板栗殼多酚濃度，從而更有利于多酚的溶出[12]。因此，在實際生產中可以采用適當加大料液比的方法來獲得最大的提取率，但過大的料液比會增加水的用量，多酚含量幾乎不變，同時在工業上出現用水量大、經濟支出高、不易濃縮的問題。

2.3.2 超聲波時間對多酚提取率的影響

以超聲時間為橫坐標，以板栗殼多酚提取率為縱坐標，考察超聲時間對多酚提取率的影響，如圖3。

圖2 料液比對多酚提取率的影響Fig.2 Effects of solid-liquid ratio on the extraction rate of polyphenols

圖3 超聲時間對多酚提取率的影響Fig.3 Effects of ultrasound time on the extraction rate of polyphenols

由圖3可知，隨著超聲時間的增加，板栗殼多酚的提取率逐漸增大，從1.5 h處增長開始變緩慢。原因可能是過長的超聲時間會導致部分板栗殼多酚發生氧化，因損耗而影響提取率。由此設定1.5 h為較優超聲時間。

2.3.3 超聲波功率對多酚提取率的影響

以超聲功率為橫坐標，以板栗殼多酚提取率為縱坐標，考察超聲功率對多酚提取率的影響，如圖4。

由圖4可知，隨著超聲功率的增大，板栗殼多酚提取率先增大后減小，在功率400 W處出現峰值，說明較優的超聲功率為400 W。

2.3.4 超聲波溫度對多酚提取率的影響

以超聲溫度為橫坐標，以板栗殼多酚提取率為縱坐標，考察超聲溫度對多酚提取率的影響，如圖5。

圖4 超聲功率對多酚提取率的影響Fig.4 Effects of ultrasound power on the extraction rate of polyphenols

圖5 超聲溫度對多酚提取率的影響Fig.5 Effects of ultrasound temperature on the extraction rate of polyphenols

由圖5可知，板栗殼多酚提取率整體隨著超聲溫度升高而增大，提取率先逐漸增大，但在65℃處開始呈現減小趨勢。原因可能是隨著溫度的升高，部分板栗殼多酚氧化損耗。因溫度65℃處出現峰值，故設定65℃為較優的超聲溫度。

2.4 超聲波提取正交試驗

根據單因素試驗結果，設定正交因素水平表1，按照L9（34）正交表進行正交試驗見表2。

表1 正交因素水平表Table 1 Factors and levels of this experiment

由正交試驗表得出最優提取工藝條件為A3B1C1D2，即液料比 1 ∶45（g/mL）、超聲時間 1 h、超聲功率350 W、超聲溫度65℃。經驗證，在最優提取工藝條件下板栗殼多酚的提取率達到96.9%，該結果比正交表中試驗號8的提取率略低，原因可能是各單因素之間存在交互作用。但試驗號8耗時更長、超聲溫度更高，從生產成本方面考慮不具優勢。

3 板栗殼抗氧化試驗

3.1 板栗殼多酚的總抗氧化性

按照1.5.1試驗方法進行試驗，以板栗殼多酚濃度為橫坐標，以吸光度A為縱坐標，板栗殼多酚的總抗氧化能力如圖6。

圖6 板栗殼多酚的總抗氧化能力Fig.6 Total antioxidant capacity of polyphenols from Chestnut Shell

由圖6可知，在一定濃度范圍內，板栗殼多酚提取液的總抗氧化能力隨著質量濃度的增加而增強，且板栗殼多酚的總抗氧化能力整體優于VC。本試驗結果與其買古麗·阿沙木等[8]研究的野薔薇多酚總抗氧化實驗趨勢基本相同，區別在于野薔薇多酚的總抗氧化能力弱于VC。

3.2 板栗殼多酚對DPPH·的清除作用

按照1.5.2試驗方法進行試驗，以板栗殼多酚濃度為橫坐標，以DPPH·的清除率為縱坐標，板栗殼多酚清除DPPH·的效果如圖7。

圖7 板栗殼多酚清除DPPH·的效果Fig.7 Effects of scavenging DPPH·on polyphenols from Chestnut Shell

植物多酚可與DPPH·中的單電子配對，從而發生氧化使紫色醇溶液出現褪色現象。由圖7可看出，板栗殼多酚和VC都具有清除DPPH·的能力。當板栗殼多酚濃度低于25 μg/mL時，其清除DPPH·能力優于VC；當板栗殼多酚濃度高于25 μg/mL時，其清除能力弱于VC，且其清除能力隨著質量濃度的增加而減弱，究其原因，相關文獻并未給出解釋，具體原因還有待進一步探究。從李霄等[9]研究馬鈴薯皮多酚清除DPPH·試驗中發現了類似結果，即低濃度馬鈴薯皮多酚清除DPPH·能力優于VC，高濃度馬鈴薯皮多酚清除DPPH·能力弱于VC。由此可說明，在低濃度條件下板栗殼多酚清除DPPH·的能力比VC強。

3.3 板栗殼多酚對超氧陰離子的清除作用

按照1.5.3試驗方法進行試驗，以板栗殼多酚濃度為橫坐標，以O2-·的清除率為縱坐標，板栗殼多酚清除O2-·的效果如圖 8。

圖8 板栗殼多酚清除O2-·的效果Fig.8 Effects of scavenging O2-·on polyphenols from Chestnut Shell

由圖8可看出，板栗殼多酚清除O2-·能力整體弱于VC。隨著質量濃度的增加，VC的清除能力逐漸增大，而板栗殼多酚在質量濃度為20 μg/mL時出現清除率峰值。當濃度高于20 μg/mL時，板栗殼多酚的清除能力隨著質量濃度的增加逐漸減弱，且在120 μg/mL時趨于平緩。從李霄等[9]及劉寧等[13]研究試驗中發現類似現象，但均未給出合理解釋，出現該現象的具體原因還有待進一步探究。因此，在低濃度條件下板栗殼多酚具有清除O2-·的能力。

3.4 板栗殼多酚對ABTS+·的清除作用

按照1.5.4試驗方法進行試驗，以板栗殼多酚濃度為橫坐標，以ABTS+·的清除率為縱坐標，板栗殼多酚清除ABTS+·的效果如圖9。

圖9 板栗殼多酚清除ABTS+·的效果Fig.9 Effects of scavenging ABTS+·on polyphenols from Chestnut Shell

ABTS經氧化后會生成藍綠色ABTS+·，植物多酚可清除ABTS+·，從而使ABTS+·母液在一定程度褪色。由圖9可看出，板栗殼多酚和VC都有清除ABTS+·的能力，且它們的清除能力都隨著質量濃度的增加而增大。謝惠等[14]研究發現紅棗多酚對ABTS+·有一定的清除能力，在一定范圍內其清除能力隨著紅棗多酚濃度增加而增大，但其清除率明顯低于VC。而本試驗板栗殼多酚清除ABTS+·的能力優于VC，說明板栗殼多酚具有較好的清除ABTS+·的能力。

3.5 板栗殼多酚對亞硝酸鹽的清除作用

按照1.5.5試驗方法進行試驗，以板栗殼多酚濃度為橫坐標，以亞硝酸鹽的清除率為縱坐標，板栗殼多酚清除亞硝酸鹽的效果如圖10。

亞硝酸鈉在弱酸性的條件下，與對氨基苯磺酸和鹽酸萘乙二胺反應后會生成紅色絡合物，該紅色絡合物溶液在536 nm處有強吸收[15]。當有抗氧化劑存在時，紅色絡合物溶液會在一定程度褪色。由圖10可看出，板栗殼多酚和VC都有一定的清除亞硝酸基的能力，它們的清除能力都隨著質量濃度的增加而增大，且整體上板栗殼多酚的清除能力比VC更強。亞硝酸鹽為強氧化劑，主要在腌肉、泡菜中出現，食用后經體內胃酸作用轉化成亞硝胺，亞硝胺為強致癌物。因此，板栗殼多酚在該領域具有很好的應用潛力。

圖10 板栗殼多酚清除亞硝酸鹽的效果Fig.10 Effects of scavenging nitrite on polyphenols from Chestnut Shell

3.6 板栗殼多酚對羥自由基的清除作用

按照1.5.6試驗方法進行試驗，以板栗殼多酚濃度為橫坐標，以·OH的清除率為縱坐標，板栗殼多酚清除·OH的效果如圖11。

圖11 板栗殼多酚清除·OH的效果Fig.11 Effects of scavenging·OH on polyphenols from Chestnut Shell

羥自由基能誘導DNA鏈斷裂和堿基改性從而引發腫瘤等疾病。植物多酚可通過清除羥自由基來減少羥自由基的產生，此時在510 nm下吸光度會降低。由圖11可看出，板栗殼多酚對羥自由基的清除作用隨著多酚濃度的增加逐漸降低，出現該現象的具體原因有待進一步探究，而VC對羥自由基的清除能力隨著質量濃度的增加逐漸增強。當板栗殼多酚濃度低于55 μg/mL時，其清除羥自由基的能力優于VC；當板栗殼多酚濃度高于55 μg/mL時，其清除羥自由基的能力弱于VC。

4 結論

1）利用超聲波水提法從板栗殼中提取多酚化合物，通過正交試驗得到影響板栗殼多酚提取因素的主次順序為：C（超聲板栗殼功率）＞B（超聲時間）＞A（料液比）＞D（超聲溫度）；并得到最優提取工藝條件：A3B1C1D2，即液料比 1 ∶45（g/mL）、超聲時間 1 h、超聲功率350 W、超聲溫度65℃，在該提取工藝條件下板栗殼多酚的提取率達到96.9%。

2）板栗殼多酚總抗氧化能力優于VC，對5種抗氧化體系均有一定的清除能力，且在一定質量濃度下其對 DPPH·、ABTS+·、NaNO2和·OH 的清除效果優于VC。因此，板栗殼多酚是一種良好的天然抗氧化劑，在食品、藥品和化妝品等領域具有廣闊的應用前景。