生姜黃酮提取工藝優(yōu)化研究

（南陽理工學(xué)院生化學(xué)院，河南省工業(yè)微生物資源與發(fā)酵技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南南陽473004）

生姜（Zingiber officinale Roscoe）是姜科姜屬草本宿根植物的根莖，我國大部分地區(qū)均有種植，主要品種有：黃爪姜、紅爪姜、來鳳姜、野生姜等二十余種。生姜是眾多食品加工生產(chǎn)過程中不可或缺的香辛味調(diào)料，其含多種化學(xué)成分，如：生姜酚、生姜精油、生姜黃酮、姜辣素、姜黃素等[1-6]。研究發(fā)現(xiàn)，生姜中含有的生姜黃酮，具有降血脂、降血壓、抗心腦血管疾病、抗腫瘤、抗菌、抗炎、抗氧化、抗衰老等生理活性[7-14]。生姜中的黃酮類化合物是其主要的抗氧化成分，對(duì)生姜中的黃酮類化合物進(jìn)行提取，將其作為食品中的天然抗氧化劑使用，有利于生姜的高值化利用。

植物組織中活性成分提取工藝的研究通常方法是在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)、回歸試驗(yàn)設(shè)計(jì)等進(jìn)行多因素試驗(yàn)研究，通過對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行極差分析和方差分析得到優(yōu)化結(jié)果，或者建立試驗(yàn)指標(biāo)與影響因素之間的回歸方程，通過對(duì)回歸方程進(jìn)行尋優(yōu)求得最佳目標(biāo)值和各影響因素的最優(yōu)值。上述試驗(yàn)方法獲得的優(yōu)化結(jié)果與實(shí)際最佳結(jié)果常存在較大的誤差。

人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（artificial neural network，ANN）是對(duì)人類大腦神經(jīng)元處理信息的模擬，可根據(jù)輸入和輸出數(shù)據(jù)進(jìn)行學(xué)習(xí)訓(xùn)練及仿真模擬，網(wǎng)絡(luò)的信息儲(chǔ)存于連接權(quán)矩陣之中，適合于各種具有非線性關(guān)系數(shù)據(jù)之間的擬合。誤差反向傳播（back propagation，BP）神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型是目前應(yīng)用最廣泛的ANN模型。BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)可通過對(duì)具有復(fù)雜的非線性關(guān)系數(shù)據(jù)進(jìn)行大量地學(xué)習(xí)和訓(xùn)練，高效地逼近任意函數(shù)，但其在學(xué)習(xí)及訓(xùn)練過程中存在收斂速度慢、容易受到局部極值的干擾等不足[15-18]。遺傳算法是一種具有導(dǎo)向性的概率搜索隨機(jī)優(yōu)化算法，可通過計(jì)算機(jī)程序模擬自然界中生物遺傳信息的遺傳、選擇和變異機(jī)制，優(yōu)化BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的性能，克服其在學(xué)習(xí)及訓(xùn)練過程中存在的收斂速度慢、容易受到局部極值干擾等缺陷，從而提高BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的性能，準(zhǔn)確求出形式未知函數(shù)的最優(yōu)解[19-23]。

本文采用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)對(duì)影響生姜黃酮得率的3個(gè)顯著性的因素與生姜黃酮得率之間的非線性關(guān)系進(jìn)行程序模擬，將通過多次學(xué)習(xí)及訓(xùn)練后具有較強(qiáng)逼近能力的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)應(yīng)用于生姜黃酮得率的預(yù)測(cè)，在此基礎(chǔ)上，利用遺傳算法對(duì)BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型進(jìn)行全局優(yōu)化求解，精確求得3個(gè)對(duì)生姜黃酮得率影響顯著的因子的最佳水平，并與單因素試驗(yàn)、析因試驗(yàn)結(jié)果相結(jié)合，確定生姜黃酮最優(yōu)的提取工藝參數(shù)，以期為生姜黃酮進(jìn)一步的開發(fā)研究提供參考依據(jù)。研究中的試驗(yàn)設(shè)計(jì)采用minitab軟件進(jìn)行，BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建模的程序編寫及遺傳算法優(yōu)化求解采用MATLAB軟件進(jìn)行。

1 材料與方法

1.1 原料

生姜：南陽市長(zhǎng)江路萬德隆超市。

1.2 試劑

蘆丁：中國藥品生物制品檢定所；乙醇：天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；石油醚（60℃～90℃）、鹽酸：山東嘉穎化工科技有限公司；正丁醇：杭州邦易化工有限公司；氫氧化鈉、硝酸鋁、氯仿、亞硝酸鈉：南京化學(xué)試劑股份有限公司；以上試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 儀器設(shè)備

FW-100高速萬能粉碎機(jī)、101-2A電熱鼓風(fēng)干燥箱：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；HB高精度天平：蘇州坤宏電子有限公司；TDL-40B臺(tái)式高速離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；752N紫外可見分光光度計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；SYG-6數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州朗越儀器制造有限公司；HZQ-Q全溫恒溫振蕩搖床：常州市瑞華儀器制造有限公司；RE-5003E旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：鞏義市宇翔儀器有限公司。

2 方法

2.1 生姜黃酮提取液的制備

將生姜清洗干凈，切片，晾干后進(jìn)行粉碎，粉碎后的原料過40目篩，并用石油醚進(jìn)行脫脂處理，脫脂后的原料按比例加入不同濃度的乙醇進(jìn)行浸提，提取液經(jīng)離心分離后采用sevage法充分脫蛋白即得生姜黃酮提取液。

2.2 生姜黃酮含量的測(cè)定

黃酮類化合物在亞硝酸鹽作用下，與Al（NO3）3發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)生成黃色鋁絡(luò)合物，在堿性條件下顯紅色，507 nm波長(zhǎng)下有最大吸收波長(zhǎng)[24]，因此可采用NaNO2-Al（NO3）3顯色法，以蘆丁作為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線[25]，以507 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)測(cè)定吸光值，對(duì)比蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算黃酮含量。

2.3 單因素試驗(yàn)

分別稱取經(jīng)石油醚脫脂處理的生姜粉2.0 g，考察不同乙醇濃度（40%、50%、60%、70%、80%、90%）、提取溫度（40、50、60、70、80 ℃）、料液比[1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30、1 ∶35、1 ∶40（g/mL）]、提取時(shí)間（30、60、90、120、150 min）等因素對(duì)生姜黃酮得率的影響，實(shí)際操作時(shí)，每次試驗(yàn)將其中3個(gè)因素固定，將樣品置于恒溫振蕩器中，調(diào)節(jié)振蕩速度120 r/min進(jìn)行振蕩提取，提取一次，考查另一因素對(duì)生姜黃酮得率的影響。

2.4 析因試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用Plaekett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)的方法對(duì)影響生姜黃酮得率的因素進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，分別用1、-1代表每個(gè)因素中黃酮得率最高和最低的水平[26]。試驗(yàn)的因素水平表如表1所示。

2.5 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)析因試驗(yàn)結(jié)果，選取對(duì)生姜黃酮得率影響顯著的3個(gè)因素：乙醇濃度、提取溫度、料液比為自變量，每個(gè)因素選擇3個(gè)水平，以生姜黃酮得率為響應(yīng)值，進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)[27-28]，具體的因素水平表如下。

表1 Plaekett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素水平Table 1 Factors and levels of Plaekett-Burman experiment design

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素水平及編碼值Table 2 Levels of factor and coded value of Box-Behnken experiment design

2.6 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的建立

在利用MATLAB軟件編程時(shí)，利用rand函數(shù)隨機(jī)確定Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果的12組數(shù)據(jù)作為擬建立的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的學(xué)習(xí)樣本，根據(jù)影響生姜黃酮得率的因素個(gè)數(shù)和待優(yōu)化指標(biāo)個(gè)數(shù)設(shè)計(jì)BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)，結(jié)合試驗(yàn)實(shí)際確定BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)為輸入層、隱含層、輸出層，輸入層有3個(gè)節(jié)點(diǎn)，分別是乙醇濃度、提取溫度、料液比，故輸入層神經(jīng)元選擇個(gè)數(shù)選擇3，隱層神經(jīng)元個(gè)數(shù)根據(jù)經(jīng)驗(yàn)選擇10，輸出層只有1個(gè)節(jié)點(diǎn)，即黃酮得率，故輸出層神經(jīng)元個(gè)數(shù)選擇1；其中輸入層傳遞函數(shù)采用logsig函數(shù)，隱含層傳遞函數(shù)采用tansig函數(shù)，輸出層傳遞函數(shù)采用purelin函數(shù)[29]；為提高神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的逼近能力和泛化能力，選擇神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的收斂精度為10-3。

2.7 遺傳算法優(yōu)化求解

2.7.1 遺傳算法優(yōu)化求解的原理

將Box-Behnken試驗(yàn)的數(shù)據(jù)作為BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的學(xué)習(xí)樣本輸入網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行訓(xùn)練，建立乙醇濃度、提取溫度和料液比與生姜黃酮得率之間的非線性映射關(guān)系，并將反映此非線性映射關(guān)系的“信息”儲(chǔ)存在BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的連接權(quán)上，利用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)具有的記憶能力形成一個(gè)“虛擬”的函數(shù)，此函數(shù)并無明確的數(shù)學(xué)表達(dá)式，可將其視為非線性的“黑箱”，利用遺傳算法優(yōu)化BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)各層的連接權(quán)值，使優(yōu)化后的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)能夠精確地預(yù)測(cè)形式未知函數(shù)的輸出值[30]。

2.7.2 遺傳算法全局尋優(yōu)求解

以BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的輸出值作為待求解的形式未知的函數(shù)的適應(yīng)度值，以Box-Behnken試驗(yàn)的數(shù)據(jù)作為初始種群，種群規(guī)模15，交叉概率0.05，變異概率0.01，重復(fù)進(jìn)行選擇、交叉和變異程序，篩選出適應(yīng)度值最大的優(yōu)秀基因，從而得到遺傳算法優(yōu)化的結(jié)果[31]。

3 結(jié)果與分析

3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制結(jié)果

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of rutin

以蘆丁含量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得一元線性回歸方程為：

y=0.339 5x+0.007 8，R2=0.997 5

3.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 乙醇濃度對(duì)生姜黃酮得率的影響

乙醇濃度對(duì)生姜黃酮得率的影響見圖2。

圖2 乙醇濃度對(duì)生姜黃酮得率的影響Fig.2 The effect of ethanol concentration on yield of Zingiber officinale Roscoe flavonoids

由圖2可知，乙醇濃度為50%時(shí)生姜黃酮得率最大，若乙醇濃度大于50%，則生姜黃酮得率隨乙醇濃度的增大而逐漸下降，可能是由于乙醇濃度過高時(shí)，醇溶性雜質(zhì)溶出量增大，與黃酮類化合物競(jìng)爭(zhēng)性地與醇-水分子結(jié)合，從而使生姜黃酮得率降低。

3.2.2 提取溫度對(duì)生姜黃酮得率的影響

提取溫度對(duì)生姜黃酮得率的影響見圖3。

圖3 提取溫度對(duì)生姜黃酮得率的影響Fig.3 The effect of extraction temperature on yield of Zingiber officinale Roscoe flavonoids

由圖3可知，提取溫度為40℃～60℃時(shí)，生姜黃酮得率隨提取溫度的升高逐漸增大，提取溫度為60℃時(shí)，生姜黃酮得率最大，若提取溫度大于60℃，則生姜黃酮得率隨提取溫度的升高迅速下降，可能是提取溫度過高會(huì)加速生姜中黃酮類化合物的氧化，導(dǎo)致生姜黃酮得率下降。

3.2.3 料液比對(duì)生姜黃酮得率的影響

料液比對(duì)生姜黃酮得率的影響見圖4。

圖4 料液比對(duì)生姜黃酮得率的影響Fig.4 The effect of solid-liquid ratio on yield of Zingiber officinale Roscoe flavonoids

由圖 4可知，當(dāng)料液比小于 1∶35（g/mL）時(shí)，生姜黃酮得率隨料液比的增加逐漸增大，當(dāng)料液比為1∶35（g/mL）時(shí)，生姜黃酮得率最大，若料液比大于1∶35（g/mL），則生姜黃酮得率迅速下降，可能是由于料液比過大不利于浸提體系的傳質(zhì)和傳熱，導(dǎo)致生姜黃酮得率下降。

3.2.4 提取時(shí)間對(duì)生姜黃酮得率的影響

提取時(shí)間對(duì)生姜黃酮得率的影響見圖5。

由圖5可知，提取時(shí)間在30 min～90 min時(shí)，生姜黃酮得率隨提取時(shí)間的增加，上升趨勢(shì)明顯，若提取時(shí)間大于90 min，可能是由于隨提取時(shí)間的增加，部分黃酮類化合物分解，使生姜黃酮得率呈下降趨勢(shì)。

圖5 提取時(shí)間對(duì)生姜黃酮得率的影響Fig.5 The effect of extraction time on yield of Zingiber officinale Roscoe flavonoids

3.3 析因試驗(yàn)結(jié)果

析因試驗(yàn)結(jié)果見表3、表4。

表3 N=4的析因試驗(yàn)設(shè)計(jì)與響應(yīng)值Table 3 Factorial experiment design and response value（N=4）

表4 各因素的方差分析表Table 4 Variance analysis of factors

由表 4 可知，提取時(shí)間的 P（0.903）＞0.05，故提取時(shí)間對(duì)生姜黃酮得率的影響不顯著，結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇提取時(shí)間為90 min進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。乙醇濃度的 P（0.016）＜0.05、提取溫度的 P（0.043）＜0.05、料液比的 P（0.009）＜0.05，說明在顯著性水平 α=0.05的條件下，乙醇濃度、提取溫度、料液比對(duì)生姜黃酮得率具有顯著性影響[32]，故選擇其作為Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因子，并對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化。

3.4 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型建立

Box-Behnken試驗(yàn)方案與結(jié)果見表5。

表5 Box-Behnken試驗(yàn)方案與結(jié)果Table 5 The design and results of Box-Behnken experiment

續(xù)表5 Box-Behnken試驗(yàn)方案與結(jié)果Continue table 5 The design and results of Box-Behnken experiment

基于Box-Behnken試驗(yàn)的數(shù)據(jù)，利用MATLAB軟件編程時(shí)，采用rand函數(shù)隨機(jī)選取12組數(shù)據(jù)作為BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的學(xué)習(xí)及訓(xùn)練樣本，建立BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型，其余3組數(shù)據(jù)作為測(cè)試樣本用以檢驗(yàn)所建立的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的泛化能力和逼近能力，BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的學(xué)習(xí)及訓(xùn)練過程如圖6所示。

圖6 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)學(xué)習(xí)及訓(xùn)練過程Fig.6 The learning and training process of BP neural network

由圖6可知，當(dāng)采用貝葉斯正則化算法對(duì)BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行訓(xùn)練時(shí)，經(jīng)9 606次迭代訓(xùn)練，BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的訓(xùn)練誤差平方和達(dá)10-3時(shí)，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)收斂，訓(xùn)練停止。

試驗(yàn)值與BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)值的對(duì)比如圖7所示。

圖7 試驗(yàn)值與BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)值的對(duì)比Fig.7 The comparison between experimental value and predictive value of BP neural network

由圖7可知，BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)輸出值（預(yù)測(cè)值）和測(cè)試樣本的試驗(yàn)值擬合度較好，說明BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型具有較強(qiáng)的逼近能力，能較為精確地?cái)M合輸入層的樣本數(shù)據(jù)，可用于生姜黃酮得率的預(yù)測(cè)。

3.5 遺傳算法優(yōu)化求解結(jié)果

利用遺傳算法對(duì)BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)各層的連接權(quán)值進(jìn)行優(yōu)化，以使適應(yīng)度值精確地逼近最優(yōu)解，遺傳算法優(yōu)化求解的軌跡如圖8所示。

圖8 遺傳算法尋優(yōu)過程Fig.8 The optimizing computation process of genetic algorithm

經(jīng)過200代選擇、交叉和變異操作，遺傳算法優(yōu)化求解的結(jié)果為：乙醇濃度58.9296%，提取溫度63.0709℃，料液比1∶37.219 8（g/mL），最佳的目標(biāo)函數(shù)值即最優(yōu)適應(yīng)度（生姜黃酮得率）為14.749 3mg/g。為便于實(shí)際操作，對(duì)遺傳算法優(yōu)化求解的結(jié)果進(jìn)行適當(dāng)修正如下：乙醇濃度59%，提取溫度63℃，料液比1∶37（g/mL）。

3.6 最優(yōu)提取工藝的驗(yàn)證

將單因素試驗(yàn)結(jié)果、析因試驗(yàn)結(jié)果及基于BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的遺傳算法優(yōu)化求解修正后的結(jié)果相結(jié)合，可得生姜黃酮最優(yōu)提取工藝為：乙醇濃度59%，提取溫度 63℃，料液比 1∶37（g/mL），提取時(shí)間 90 min，提取一次。根據(jù)此條件進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)并取平均值，結(jié)果為14.685 2 mg/g，變異系數(shù)CV即（標(biāo)準(zhǔn)差/平均值×100%）為3.63%，說明結(jié)果可信度較高。

4 結(jié)論

1）在單因素試驗(yàn)及析因試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)安排試驗(yàn)，利用Box-Behnken試驗(yàn)的數(shù)據(jù)構(gòu)建BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型，用于模擬提取過程中對(duì)黃酮得率影響顯著的因子與黃酮得率之間的非線性關(guān)系，采用貝葉斯正則化算法對(duì)建立的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行訓(xùn)練，經(jīng)9 606次迭代訓(xùn)練，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)收斂，收斂精度達(dá)10-3，說明該神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型已具有較強(qiáng)的泛化和逼近能力，可將其應(yīng)用于生姜黃酮提取工藝參數(shù)的預(yù)測(cè)求解。

2）利用遺傳算法對(duì)所建立的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行全局尋優(yōu)，并結(jié)合實(shí)際條件，將遺傳算法優(yōu)化求解結(jié)果及單因素試驗(yàn)、析因試驗(yàn)結(jié)果相結(jié)合，可得生姜黃酮最優(yōu)提取工藝為：乙醇濃度59%，提取溫度63℃，料液比 1 ∶37（g/mL），提取時(shí)間 90 min，提取一次。根據(jù)此條件進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)并取平均值，結(jié)果為14.685 2 mg/g。

綜上所述，BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型具有較高的仿真精度，能夠較為精確地?cái)M合對(duì)生姜黃酮提取有顯著影響的因素與得率之間的非線性關(guān)系，其在提取工藝參數(shù)優(yōu)化方面具有較強(qiáng)的泛化和逼近能力，并且與遺傳算法結(jié)合經(jīng)過多次世代進(jìn)化即可完成全局尋優(yōu)求解，獲得最優(yōu)的、最接近客觀實(shí)際的提取工藝參數(shù)，此方法也為其他具有開發(fā)應(yīng)用潛力的農(nóng)產(chǎn)品中黃酮類化合物的提取研究提供了新的思路。