響應面設計優化玫瑰茄花色苷提取工藝

孟翔宇，趙彥巧，李建穎

（天津商業大學生物技術與食品科學學院，天津市食品生物技術重點實驗室，天津300134）

玫瑰茄（Hibiscus sabdariffa）是藥食兩用植物，又名洛神花，是錦葵科木槿屬一年生植物[1]。其中富含豐富的花色素、酚類、氨基酸、有機酸和礦物質等多種營養成分[2]。然而，作為天然色素的一大類-花色苷，受到了各界人士的普遍重視。近年來研究發現，花色苷不僅在不同溶劑條件下可呈現紅、藍、紫等不同顏色，能滿足不同的著色需求[3]，而且安全無毒，并具有較強的抗氧化[4-7]、抗炎癥[8]、抗癌[9-11]，能力和顯著的心血管保護能力[12-13]。根據文獻報道，玫瑰茄花色苷的提取方法有超聲輔助提取法[14]、溶劑提取法[15]和微波提取法[16]。但是已有方法普遍存在溶劑使用量大、作用時間長、原料損耗嚴重等問題，導致花色苷提取率低，穩定性不高，給后續的開發利用帶來難度。

超聲波能產生一系列空化效應以及強烈的振動擊碎和擴散等復雜的多級效應，提高分子的振動頻率，增強溶劑的穿透力，來促進提取[17]。微波的熱效應和形成的局部壓力可破壞生物原料的細胞結構，加速內容物的溶出[18-19]。而新型超聲-微波協同提取充分利用超聲波的空化作用以及微波的熱效應，使超聲波產生的振蕩作用能有效彌補微波傳熱、傳質不均等缺陷，微波極佳的熱效應能有效地彌補超聲產熱不足的問題[20]。本研究利用超聲-微波協同萃取儀進行提取，并結合響應面試驗設計優化玫瑰茄花色苷的提取工藝，來實現低溫常壓條件下對樣品進行快速、高效的提取。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玫瑰茄：云南武定；氯化鉀（AR）：天津市光復科技發展有限公司；濃鹽酸（AR）：天津化學試劑五廠；無水醋酸鈉（AR）：國藥集團化學試劑有限公司；無水乙醇（AR）：天津市風船化學試劑科技有限公司。

1.2 儀器與設備

RHP-400型高速多功能粉碎機：浙江榮浩工貿有限公司；UV-2600紫外-可見分光光度計：日本島津；真空冷凍干燥系統：科儀創智（北京）科技發展有限公司；STARTER 3100 pH計、AX224ZH分析天平：奧豪斯儀器（常州）有限公司；XO-SM100超聲-微波協同萃取儀：南京先歐儀器制造有限公司；RV10數顯型旋轉蒸發儀：德國IKA；-80℃低溫保存箱：青島海爾特種電器有限公司；DLK-2007快速低溫冷卻循環機：寧波新芝生物技術股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 玫瑰茄原料預處理

挑選無腐爛霉變的玫瑰茄干花萼，40℃烘干，經粉碎機處理，過40目～60目標準篩，得原材料，密封冷藏備用。

1.3.2 玫瑰茄花色苷提取工藝

稱取玫瑰茄原材料2.5 g，按液料比36∶1（mL/g）加入乙醇溶液（pH=3），安裝好冷凝回流裝置，設置超聲功率350 W，微波功率279 W，提取溫度50℃，應用超聲微波萃取儀，提取18 min，抽濾，測定吸光度。

1.3.3 花色苷吸收波長的測定

在190 nm～700 nm下對玫瑰茄花色苷進行全波長掃描，確定其最大吸收波長。

1.3.4 花色苷含量的測定

參照pH示差法[21]測定總花色苷含量。取玫瑰茄花色苷提取液，分別加入pH1.0[0.2 mol/L HCl∶0.2 mol/L KCl=25 ∶67（體積比）]和 pH4.5[1.0 mol/L CH3COONa∶1.0 mol/L HCl∶H2O=100∶60∶90（體積比）]的緩沖溶液，將花色苷提取液稀釋10倍，室溫下平衡80 min，以蒸餾水作參比，在520 nm和700 nm下測定吸光度，花色苷提取量按以下公式計算：

式中：M為矢車菊素葡萄糖苷（Cyanidin-3-glucoside） 的分子量，449.2 g/mol；W 為樣品質量，g；V為提取液體積，mL；F為稀釋倍數；ε為摩爾消光系數26 900 L（/mol·cm）；A為總吸光度。

1.3.5 響應面試驗優化花色苷提取工藝

響應面試驗因素與水平見表1。

2 結果與分析

2.1 紫外-可見掃描光譜

玫瑰茄花色苷紫外-可見吸收光譜如圖1所示。

圖1 花色苷紫外可見光譜Fig.1 UV-visible spectrum of anthocyanin

由圖1可見，玫瑰茄花色苷在283 nm和520 nm有最大吸收，符合花色苷的特征吸收。而干擾花色苷分析的其他類黃酮化合物，在紫外區240 nm～285 nm有特征吸收峰[22]，這與吳慶智等[23]研究報道一致。因此，將520 nm作為玫瑰茄花色苷的最大特征吸收波長。且該物質在327 nm也有吸收，推斷該花色苷中可能有酰基存在[24]。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 超聲功率對花色苷提取量的影響

乙醇體積分數 60%，液料比 35 ∶1（mL/g），微波功率280 W，提取溫度50℃，提取18 min，考察不同超聲功率對花色苷提取量的影響，如圖2所示。

圖2 超聲功率對花色苷提取量的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on the yield of anthocyanin

由圖2可見，隨超聲功率增加，花色苷提取量呈現先增加后減小趨勢，最大提取量為772.9 mg/100 g。但超聲功率超過350 W時，超聲功率對花色苷提取量的影響不顯著，所以后續不再進行響應面優化設計。因此，本研究確定最佳的超聲功率為350 W。

2.2.2 提取溫度對花色苷提取量的影響

乙醇體積分數 60%，液料比 35 ∶1（mL/g），超聲功率350 W，微波功率280 W，提取18 min，考察不同提取溫度對花色苷提取量的影響，如圖3所示。

圖3 提取溫度對花色苷提取量的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on the yield of anthocyanin

由圖3可見，隨溫度的升高，花色苷提取量逐漸增加后緩慢降低；當溫度為50℃時，花色苷提取量達到最大，為774.7 mg/100 g。主要原因是，溫度較低時，溶液分子運動速度較低，不利于花色苷物質的溶出；溫度過高時會破壞花色苷的結構，所以后續不再進行響應面優化設計。因此，確定花色苷最適提取溫度為50℃。

2.2.3 微波功率對花色苷提取量的影響

乙醇體積分數 60%，液料比 35 ∶1（mL/g），超聲功率350 W，提取溫度50℃，提取18 min，考察不同微波功率對花色苷提取量的影響，如圖4所示。

圖4 微波功率對花色苷提取量的影響Fig.4 Effects of microwave power on the yield of anthocyanin

由圖4可見，隨微波功率逐漸增加，花色苷提取量首先呈現上升趨勢，當微波功率為280 W時，花色苷提取量達到最大值，為770.3 mg/100 g；微波功率繼續增加，花色苷提取量降低。主要原因是，微波功率較低時，系統能穩定在花色苷的最適溫度，可以使玫瑰茄中的花色苷逐漸的溶出；當微波功率過高時，系統溫度也會隨之升高，導致已經溶出的花色苷結構遭到破壞，使其變性，造成花色苷的損失。因此，本研究選取微波功率280 W。

2.2.4 提取時間對花色苷提取量的影響

乙醇體積分數 60%，液料比 35 ∶1（mL/g），超聲功率350 W，微波功率280 W，提取溫度50℃，考察不同提取時間對花色苷提取量的影響，如圖5所示。

圖5 提取時間對花色苷提取量的影響Fig.5 Effects of extraction time on the yield of anthocyanin

由圖5可見，隨提取時間的延長，花色苷提取量先增加后降低。當提取時間為18 min時，花色苷有最大提取量，為775.1 mg/100 g。主要原因是，提取時間較短，花色苷還未完全溶出。提取時間為18 min時，花色苷溶出達到飽和，但是隨著時間延長，微波長時間照射，花色苷會發生降解，降低其含量。因此，本研究選取提取時間為18 min。

2.2.5 乙醇體積分數對花色苷提取量的影響

液料比 35 ∶1（mL/g），微波功率 280 W，超聲功率350 W，提取溫度50℃，提取18 min，考察不同乙醇體積分數對花色苷提取量的影響，如圖6所示。

圖6 乙醇體積分數對花色苷提取量的影響Fig.6 Effects of ethanol concentration on the yield of anthocyanin

由圖6可見，隨乙醇體積分數的增加，玫瑰茄花色苷提取量先升高后降低；當乙醇體積分數為60%時，花色苷提取量達到最大，為770.3 mg/100 g。主要原因是，花色苷屬于水溶性物質，乙醇體積分數過低時，提取劑極性較大，利于糖類物質的溶出，導致溶液變得粘稠，從而降低花色苷的溶出量；反之，提取劑極性過小，水溶性的花色苷與提取劑相容性較低，也會降低花色苷的溶出量。因此，本研究選取乙醇體積分數為60%。

2.2.6 液料比對花色苷提取量的影響

乙醇體積分數60%，超聲功率350 W，微波功率280 W，提取溫度50℃，提取18 min，考察不同料液比對花色苷提取量的影響，如圖7所示。

圖7 液料比對花色苷提取量的影響Fig.7 Effects of liquid/solid ratio on the yield of anthocyanin

由圖7可見，當溶劑量過小時，提取出的花色苷含量較低，當液料比為35∶1（mL/g）時，玫瑰茄花色苷提取量達到最大，為776.8 mg/100 g；溶劑量繼續增大，花色苷提取量明顯下降。主要原因是，溶劑量逐漸增加時，有利于玫瑰茄中的花色苷向溶液中擴散；但溶劑量過大會削弱超聲波和微波的輔助效果，從而影響花色苷的溶出。因此，本研究選取料液比為35∶1（mL/g）。

2.3 響應面試驗結果

2.3.1 響應面試驗方案及結果

綜合單因素試驗結果可知，超聲功率超過一定值時，對花色苷提取量影響較小；提取溫度的改變會影響花色苷的穩定性。故在固定超聲功率350 W，提取溫度50℃條件下，選取對玫瑰茄花色苷提取量影響顯著的微波功率、提取時間、乙醇體積分數、液料比4個因素進行響應面試驗設計。利用Design-Expert 8.0軟件進行數據擬合，試驗方案與結果見表2。

表2 響應面試驗結果Table 2 Results of response surface test

2.3.2 模型的建立與顯著性檢驗

利用Design-Expert 8.0軟件對表2數據進行多元回歸擬合，獲得玫瑰茄花色苷提取量（Y）對自變量微波功率（A）、提取時間（B）、乙醇體積分數（C）、液料比（D）的二元多項回歸方程：花色苷提取量=+785.84-1.78A+1.76B-2.46C+4.48D+2.53AB+0.20AC-0.63AD-1.27BC-10.33BD-9.50CD-9.61A2-7.70B2-14.20C2-15.44D2。該方程各項系數絕對值的大小直接反映了各因素對響應值的影響程度，系數的正、負反映了影響的方向[25]。花色苷提取量優化方程二次項系數均為負值，可知方程代表拋物面開口向下，有極大值點，能進行優化分析。各因素對花色苷提取量影響順序為液料比（D）＞乙醇體積分數（C）＞微波功率（A）＞提取時間（B）。對該模型進行方差分析與回歸方程可信度分析，結果分別見表3與表4。

表3 回歸模型方差分析表Table 3 Analysis of variance of the regression model

表4 回歸方程可信度分析Table 4 The credibility analysis of the regression equation

由表 3 可見，C、D、A2、B2、C2、D2對響應面的影響達到極顯著水平，四因素兩兩交互項 BD、CD（P＜0.000 1），說明時間和液料比、乙醇體積分數和液料比的交互作用影響極顯著。從整體分析，模型P＜0.000 1，表明該二次多項回歸模型達到極顯著水平；失擬項P＞0.05不顯著，表明模型與實際情況擬合較好。R2=0.992 6，R2Adj=0.985 2，C.V.=0.19%，說明方程對試驗擬合較好。

2.3.3 響應面優化分析

等高線圖可以直觀地反映兩變量交互作用的影響程度，圓形表示兩因素交互作用不顯著，而橢圓形與之相反[26]。根據回歸方程繪制響應面圖見圖8。

由表3可知，微波功率、提取時間、乙醇體積分數、液料比均為影響玫瑰茄花色苷的主要因素，各因素之間的交互影響如圖8所示。微波功率與乙醇體積分數、微波功率與液料比、提取時間與乙醇體積分數間的交互作用不顯著（圖8b、8c、8d）。圖8a顯示，當時間較短時，微波功率對花色苷提取量的影響比較顯著，花色苷提取量隨著功率增加而增加。在時間為16 min～18 min階段，微波功率280 W～290 W時的響應面坡面極陡且存在極值，二者交互作用顯著。時間與料液比、乙醇體積分數與液料比間交互作用顯著，曲面圖呈橢圓形，如圖 8e、8f。

圖8 各因素交互作用對花色苷提取量的等高線和響應面圖Fig.8 Contour and response surface plots for the effects of different factors on the extraction rate of anthocyanin

2.3.4 驗證試驗結果

通過軟件分析確定玫瑰茄花色苷最佳提取工藝為微波功率278.95 W，提取時間17.95 min，乙醇體積分數 58.45%，液料比 36.02 ∶1（mL/g），玫瑰茄花色苷的理論值為786.556 mg/100 g。考慮實際可操作性，調整參數為微波功率279 W，提取時間18 min，乙醇體積分數60%，液料比1∶36（mL/g）。此條件下進行3次平行試驗，玫瑰茄花色苷提取量為787.56 mg/100 g。與理論值相近，響應面法優化該提取方法具有一定的實際應用價值。

3 結論

響應面法優化超聲-微波協同法提取玫瑰茄中花色苷最優條件為超聲功率350 W，提取溫度50℃，微波功率279 W，提取時間18 min，乙醇體積分數60%，液料比1∶36（mL/g），玫瑰茄花色苷提取量為787.56 mg/100 g。該提取方法溶劑消耗量小、易回收，作用時間短，花色苷溶出量大。