超聲波-微波協(xié)同輔助法提取核桃蛋白工藝優(yōu)化及特性研究

余永婷，房磊，史萬禮，郭焰，謝瓊

（1.新疆輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆烏魯木齊830000；2.吉林大學(xué)，吉林長春130000；3.新疆大學(xué)，新疆烏魯木齊830000）

核桃（Juglans regia L.）又名胡桃、羌桃，屬胡桃科胡桃屬植物[1]，同扁桃、腰果、榛子并列稱為世界四大干果[2]，新疆的主要林果之一，主產(chǎn)區(qū)集中在新疆、甘肅、陜西等中西部地區(qū)[3-5]，畝產(chǎn)量最高可達(dá)400 kg[6]。核桃中除了富含大量的油脂、糖類化合物、礦物質(zhì)、維生素、磷脂等成分[7]外，還含有15%～25%[8-9]的蛋白質(zhì)，且氨基酸組成種類齊全，必需氨基酸配備合理[10-11]，符合聯(lián)合國糧農(nóng)組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations）和世界衛(wèi)生組織（World Health Organization）規(guī)定的要求，核桃蛋白能夠補(bǔ)血、潤肺、養(yǎng)神等，具有重要的生理保健作用[12]。

核桃蛋白不僅氨基酸的種類豐富而且具有生理功能等特性，被視為是一種價(jià)值較高的蛋白質(zhì)資源，所以備受人們關(guān)注，目前核桃主要用來提取油脂或以干果形式進(jìn)行銷售食用[13-14]，加工產(chǎn)品簡單，對核桃蛋白的提取主要有堿溶酸沉法、酶解法、超聲波輔助等方法，超聲波-微波輔助方法是將超聲波技術(shù)和微波技術(shù)相結(jié)合進(jìn)行提取的一種新型方法，不僅能夠縮短提取時(shí)間而且極大地提高了蛋白提取率[15]，廣泛的應(yīng)用在油脂、蛋白、多糖等物質(zhì)的提取與制備方面[16-17]。因此本文采用超聲波-微波協(xié)同輔助法對核桃蛋白進(jìn)行提取，并采用正交試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化出最佳提取工藝，對其等電點(diǎn)進(jìn)行測定，為核桃蛋白的精深加工奠定了良好的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑、儀器

核桃：市售；濃硫酸、鹽酸、乙酸、固體氫氧化鈉、對硝基苯酚、溴化鉀、甲醛、乙酰丙酮、硫酸銨、硫酸銅（均為分析純）：北京化工廠。

HYP-320型智能消化爐：上海纖檢儀器有限公司；FA1004A型電子天平：上海精天電子儀器有限公司；UWave-1000型微波-紫外-超聲波三位一體合成萃取反應(yīng)儀：上海新儀微波化學(xué)科技有限公司；RHP-350型高速多功能粉碎機(jī)：浙江容浩工貿(mào)有限公司；PHS-3D型PH計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；CT15RT型臺式高速冷凍離心機(jī)：上海天美科學(xué)儀器有限公司；Alpha1-4LP Plus型凍干機(jī)：德國有限公司；TU-1901型紫外分光光度計(jì)：北京普希通用儀器有限責(zé)任公司；HSC-3型差示掃描量熱儀：北京恒久科學(xué)儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 工藝流程及核桃蛋白提取率的計(jì)算

核桃蛋白含量及純度的測定參考GB 5009.5-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測定》中的分光光度法，提取率及蛋白純度計(jì)算見公式所示[18]。

1.2.2 核桃蛋白提取單因素試驗(yàn)

選取料液比（g/mL）、pH 值、超聲功率（W）、微波功率（W）4個單因素進(jìn)行考察[19-20]，設(shè)定料液比 1∶10、1 ∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL），pH 值8.5、9.0、9.5、10.0、10.5，超聲波功率 300、350、400、450、500 W，微波功率100、150、200、250、300 W，3 次平行試驗(yàn)取均值[21-22]。固定的單因素：核桃仁粉 100.00 g、料液比 1 ∶15（g/mL）、pH9.0、超聲波功率400 W、微波功率200 W。以核桃蛋白質(zhì)的提取率作為評價(jià)指標(biāo)。

1.2.3 核桃蛋白提取正交試驗(yàn)

核桃蛋白提取正交試驗(yàn)見表1。

表1 正交因素水平表Table 1 Orthogonal factor level table

1.3 核桃蛋白功能特性的測定

1.3.1 等電點(diǎn)的測定

將3.0 g凍干后的核桃蛋白粉末，溶解在200 mL的蒸餾水中，調(diào)至pH10.0，核桃蛋白充分溶解，0.1 mol/L的 HCl溶液調(diào)節(jié) pH 值至 3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，邊加HCl溶液邊攪拌，靜置30 min，使溶液中的蛋白沉淀完全，3 800 r/min離心15 min，棄沉淀取上清2 mL，用移液管吸取8 mL雙縮脲試劑，混合均勻，30 min后540 nm波長處測吸光度，吸光值的大小反應(yīng)了蛋白沉淀量多少，蛋白沉淀越多吸光值越小，即此時(shí)pH值就為核桃蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)[23-24]。

1.3.2 溶解度的測定

分別在不同蛋白濃度、不同pH值、不同溫度條件下對核桃蛋白溶解度進(jìn)行測定，配制濃度：10、15、20、25、30 mg/mL 的蛋白溶液；pH 值：3.0、5.0、7.0、9.0、11.0的蛋白溶液；溫度：40、50、60、70、80 ℃；攪拌 30 min，核桃蛋白充分溶解，3 800 r/min離心20 min，采用雙縮脲法測離心后溶液中的蛋白含量[25]。

1.3.3 核桃蛋白變性溫度的測定

電子天平稱取10 mg核桃蛋白，放入坩堝中，對照組：空白，溫度：30℃～500℃，以速度10℃/min升溫，記錄吸熱曲線，繪制差式掃描量熱掃描曲線[26-28（]differential scanning calorimetry，DSC）。圖像最低點(diǎn)即為蛋白的變性溫度。

2 結(jié)果分析

2.1 核桃蛋白提取單因素結(jié)果

2.1.1 料液比對蛋白提取率的影響

料液比對蛋白提取率的影響見圖1。

圖1 料液比與提取率之間的關(guān)系Fig.1 The relationship between the ratio of material to liquid and extraction rate

由圖 1 可知，料液比在 1 ∶10（g/mL）～1 ∶20（g/mL）范圍內(nèi)變化時(shí)，提取率不斷增大，料液比在1∶20（g/mL）～1∶35（g/mL）范圍內(nèi)變化，提取率下降并保持平穩(wěn)狀態(tài)，料液比在1∶20（g/mL）時(shí)，提取率最大。提取液用量增加有助于蛋白質(zhì)從內(nèi)部溶出從而提取率變大。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶出飽和，增加提取液而提取率不在上升。因此選取料液比 1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25（g/mL）進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.1.2 pH值對蛋白提取率的影響

pH值對蛋白提取率的影響見圖2。

由圖2可知，當(dāng)提取液pH值在8.5～10.5范圍內(nèi)變化時(shí)，核桃蛋白提取率隨著提取液pH值的不斷增大先上升后下降，pH 9.0時(shí)提取率出現(xiàn)峰值。蛋白是堿溶性的，適當(dāng)?shù)膒H值有助于蛋白質(zhì)溶出，pH值過大，導(dǎo)致蛋白質(zhì)內(nèi)部的可解離基團(tuán)因受強(qiáng)烈的靜電排斥作用造成分子伸展，蛋白質(zhì)變性沉淀，提取率降低。因此選pH 8.5、9.0、9.5進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖2 pH值與提取率之間的關(guān)系Fig.2 Relationship between pH and extraction rate

2.1.3 超聲波功率對蛋白提取的影響

超聲波功率對蛋白提取的影響見圖3。

圖3 超聲功率與提取率之間的關(guān)系Fig.3 Relationship between ultrasonic power and extraction rate

由圖3可知，超聲功率在300 W～500 W范圍內(nèi)變化時(shí)，提取率隨著超聲波功率增大呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，功率400 W時(shí)提取率最大，超聲波的空化效應(yīng)會使細(xì)胞壁破壞完全在提取中具有輔助作用，提高蛋白質(zhì)溶出率，提取率上升，但是功率過大，會破壞蛋白中氫鍵，破壞蛋白結(jié)構(gòu)，蛋白沉淀在細(xì)胞內(nèi)，從而提取率下降。因此選350、400、450 W進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.1.4 微波功率對蛋白提取率的影響

微波功率對蛋白提取率的影響見圖4。

微波功率在100 W～300 W之間內(nèi)變化時(shí)，提取率曲線呈先上升后下降趨勢，150 W時(shí)提取效果最佳。微波具有破壞細(xì)胞壁加速蛋白質(zhì)溶出的作用，從而提高了提取率，微波提取過程中會產(chǎn)生大量熱量，微波功率過大，溫度上升會使蛋白中的氫鍵斷開，蛋白因高溫變性，沉淀在細(xì)胞內(nèi)無法溶出，從而提取率下降。所以選微波功率100、150、200 W進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖4 微波功率對提取率的影響Fig.4 The effect of microwave power on the extraction rate

2.1.5 核桃蛋白提取工藝優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，按L9（34）設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，優(yōu)化最佳提取參數(shù)，試驗(yàn)結(jié)果見表2，正交試驗(yàn)的方差分析見表3。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Orthogonal array design matrix and results

表3 正交試驗(yàn)的方差分析Table 3 Analysis of variance for the experimental results of orthogonal array design

由表2正交試驗(yàn)顯示結(jié)果可知，超聲波-微波輔助提取對核桃蛋白提取率的影響程度分別為超聲波功率＞pH值＞料液比＞微波功率，最佳提取工藝為A2B2C2D3，即料液比 1∶20（g/mL）、pH9.0、超聲波功率400 W、微波功率200 W，該試驗(yàn)組不在正交試表中，需進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，驗(yàn)證結(jié)果為：最大提取率（93.48±1.02）%。

由表3 spss軟件結(jié)果顯示，校正模型具有顯著性，A、B、C、D 各因素的影響值 P＜0.01，表明上述 4個因素在提取過程中可作為影響提取率的首要考慮因素。

2.2 核桃蛋白功能特性測定結(jié)果

2.2.1 核桃蛋白等電點(diǎn)測定

等電點(diǎn)示意圖見圖5。

圖5 等電點(diǎn)示意圖Fig.5 Schematic view of the isoelectric point

由圖5可知，pH值在3.5～6.0之間變化，吸光值先下降后上升，pH 5.0時(shí)吸光度最小。說明在pH 5.0時(shí)溶液中的蛋白質(zhì)沉淀量最大，此時(shí)處于等電點(diǎn)，分子所帶的靜電荷為0，溶解性最差。

2.2.2 核桃蛋白濃度對溶解度影響

核桃蛋白濃度對溶解度影響見圖6。

圖6 蛋白濃度對溶解度的影響Fig.6 Effect of protein concentrations on solubility

由圖6可知，核桃蛋白在由10 mg/mL增加到30 mg/mL，蛋白的溶解度先上升出現(xiàn)最大值，然后呈現(xiàn)下降趨勢，在20 mg/mL時(shí)出現(xiàn)最大值，由于適當(dāng)?shù)脑黾拥鞍诐舛扔兄诘鞍椎某浞秩芙?，蛋白濃度過大，水分子被蛋白吸收形成過飽和溶液，導(dǎo)致溶解不完全，所以溶解度下降。

2.2.3 pH值對核桃蛋白溶解度的影響

pH值對核桃蛋白溶解度的影響見圖7。

圖7 pH值對溶解度影響Fig.7 Effect of pH on solubility

由圖7可知，溶液pH值由3.0到11.0范圍內(nèi)變化，溶解度在pH 5.0時(shí)最低，由于處于核桃蛋白的等電點(diǎn)，隨著pH值的繼續(xù)增大，溶解度逐漸上升出現(xiàn)最大值并趨于平穩(wěn)，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)易溶于堿性環(huán)境，且有最佳溶解pH值，而難溶于酸性環(huán)境。

2.2.4 溫度對核桃蛋白溶解度的影響

溫度對核桃蛋白溶解度的影響見圖8。

圖8 溫度對溶解度影響Fig.8 Effect of temperature on solubility

由圖8的試驗(yàn)結(jié)果可知，溶解度隨著溫度變化，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在溫度70℃時(shí)，溶解性最好，溫度適當(dāng)增加有利于蛋白分子伸展，吸收更多水分形成水合分子，故而溶解性較好，但溫度過高導(dǎo)致蛋白分子的天然結(jié)構(gòu)破壞，分子松散，吸水性下降，溶解性降低。

2.2.5 核桃蛋白變性溫度測定

核桃蛋白DSC掃描結(jié)果見圖9。

由圖9可知，核桃蛋白在加熱過程中呈現(xiàn)先吸熱后放熱的狀態(tài)，在DSC曲上有一個明顯的最低峰，即核桃蛋白的最大熱量吸收峰，峰頂所對應(yīng)的溫度83.80℃即為蛋白的變性溫度，溫度高于83.80℃后，蛋白質(zhì)天然結(jié)構(gòu)逐漸破壞崩塌，蛋白變性[29]。蛋白的對熱穩(wěn)性較好，這也解釋了在接近80℃溶解度下降的原因。

圖9DSC掃描結(jié)果Fig.9 The results of differential scanning calorimeter scanning

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用超聲波-微波輔助法提取核桃蛋白，選取料液比、pH值、超聲波功率、微波功率為考察因素，通過單因素試驗(yàn)結(jié)合正交試驗(yàn)，得到出最佳提取工藝參數(shù)：料液比 1 ∶20（g/mL）、pH 9.0、超聲波功率400 W、微波功率200 W，此條件下蛋白提取率最大為（93.48±1.02）%。

對核桃蛋白等電點(diǎn)測定結(jié)果顯示核桃蛋白等電點(diǎn)為pH 5.0，濃度在20 mg/mL時(shí)溶解度最大，最佳溶解溫度為70℃，在蛋白等電點(diǎn)附近溶解度最差，且隨著pH值的不斷增大溶解度不斷升高，差示熱量測量結(jié)果顯示，核桃蛋白的在83.80℃時(shí)有一個明顯的向下吸收峰，即核桃蛋白的變性溫度。