響應(yīng)面法優(yōu)化超聲提取油茶殼總黃酮及抑菌性研究

彭 玲

(宜春學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，江西宜春 336000)

黃酮類(lèi)化合物是指由2個(gè)具有酚羥基的苯環(huán)通過(guò)中央三碳原子相連接構(gòu)成的一系列化合物[1]，用C6—C3—C6表示。有研究表明，黃酮類(lèi)化合物大多與糖結(jié)合成苷，少部分以游離形式存在[2-3]。大多數(shù)植物體內(nèi)都含有黃酮類(lèi)化合物，它對(duì)植物的生長(zhǎng)、發(fā)育、開(kāi)花、結(jié)果等方面有很重要的作用。直到20世紀(jì)60年代末，人們發(fā)現(xiàn)黃酮類(lèi)化合物具有利膽、強(qiáng)心、鎮(zhèn)痛、抗氧化、抗菌、抗癌、抗心腦血管疾病、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等多種生理功能及藥理作用[4]，因此其提取物已被廣泛應(yīng)用于食品、藥品、化妝品等產(chǎn)品中。

有關(guān)報(bào)道顯示，油茶總皂苷分子極性較強(qiáng)，具有抗氧化、清除自由基的能力，但從油茶殼中提取總黃酮及其抑菌活性的研究至今較少。油茶是我國(guó)南方重要的木本油料作物，廣泛分布于江西、湖南、福建、廣東、廣西等省(自治區(qū))，資源十分豐富。據(jù)統(tǒng)計(jì)全國(guó)有油茶367萬(wàn)hm2，每年產(chǎn)油15億kg，同時(shí)將產(chǎn)生100億kg的油茶果殼[5]。本著變廢為寶的原則，如果能將數(shù)量如此龐大的油茶殼加以有效利用，將帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)效益，因此充分利用油茶殼中的黃酮類(lèi)化合物具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。

本試驗(yàn)針對(duì)油茶殼中總黃酮酶解-超聲提取工藝進(jìn)行研究，利用纖維素酶、蛋白酶、果膠酶預(yù)處理原料油茶殼[6]，然后采用單因素試驗(yàn)，確定超聲功率、乙醇濃度、提取時(shí)間為顯著因素，采用響應(yīng)面法摸索出對(duì)油茶殼總黃酮化合物提取的最佳條件，并研究其抑菌活性，旨在為油茶殼總黃酮化合物的深度開(kāi)發(fā)和工業(yè)化生產(chǎn)天然抑菌劑提供理論依據(jù)和方法指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油茶殼，購(gòu)自江西省宜春市油茶園，除雜清洗后自然風(fēng)干，粉碎過(guò)80目篩。

無(wú)水乙醇，購(gòu)自廣州雙船化學(xué)試劑廠；蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；纖維素酶、蛋白酶、果膠酶，購(gòu)自諾維信生物技術(shù)有限公司；牛肉膏、蛋白胨、瓊脂，購(gòu)自廣州味研生物科技有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FW135中草藥粉碎機(jī)，購(gòu)自上海隆拓儀器設(shè)備有限公司；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋，購(gòu)自國(guó)華電器有限公司；DL-1000A超聲波清洗器，購(gòu)自上海之信儀器有限公司；UV-5100紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，購(gòu)自上海元析儀器有限公司；CJ系列垂直、水平單向流凈化工作臺(tái)，購(gòu)自蘇州華宏凈化技術(shù)有限公司；YHR-250生化培養(yǎng)箱，購(gòu)自上海姚氏儀器設(shè)備廠。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程 纖維素酶、蛋白酶、果膠酶+原料→預(yù)處理→超聲提取→抽濾→濾液定容→測(cè)總黃酮含量。

1.3.2 酶解預(yù)處理[7]通過(guò)對(duì)油茶殼組成成分分析，可知油茶殼中含有大量的纖維素、蛋白質(zhì)、果膠等成分，因此采用一定量的纖維素酶、蛋白酶、果膠酶按照一定比例互配，對(duì)原料油茶殼進(jìn)行預(yù)處理，以提高油茶殼中總黃酮的提取率。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[8]在波長(zhǎng)為400～800 nm范圍內(nèi)做波長(zhǎng)掃描，結(jié)果表明蕓香苷在508 nm處有最大吸光度，且空白對(duì)照干擾最小。因此，在蕓香苷的最大吸收波長(zhǎng)508 nm處測(cè)定吸光度。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作，得到回歸方程y=123.82x-0.018 1(r2=0.999 0)計(jì)算總黃酮的含量。

1.3.4 單因素試驗(yàn)條件

1.3.4.1 超聲功率的影響[9]稱(chēng)取1 g油茶殼粉末，經(jīng)纖維素酶、蛋白酶、果膠酶預(yù)處理，采用50%乙醇為提取溶劑，液料比為30 mL ∶1 g，提取時(shí)間為30 min，超聲功率為200、250、300、350、400 W等5個(gè)水平進(jìn)行研究，以探討超聲功率對(duì)油茶殼總黃酮提取效果的影響。

1.3.4.2 乙醇濃度的影響[10]稱(chēng)取1 g油茶殼粉末，經(jīng)纖維素酶、蛋白酶、果膠酶預(yù)處理，采用超聲功率為200 W，液料比為30 mL ∶1 g，提取時(shí)間為30 min，乙醇濃度為30%、40%、50%、60%、70%等5個(gè)水平進(jìn)行研究，以探索乙醇濃度對(duì)油茶殼總黃酮提取效果的影響。

1.3.4.3 提取時(shí)間的影響[11]稱(chēng)取1 g油茶殼粉末，經(jīng)纖維素酶、蛋白酶、果膠酶預(yù)處理，采用50%乙醇為提取溶劑，液料比為30 mL ∶1 g，超聲功率為200 W，提取時(shí)間為30、40、50、60、70 min等5個(gè)水平進(jìn)行研究，以探索提取時(shí)間對(duì)油茶殼總黃酮提取效果的影響。

1.3.4.4 液料比的影響[12-13]稱(chēng)取1 g油茶殼粉末，經(jīng)纖維素酶、蛋白酶、果膠酶預(yù)處理，采用50%乙醇為提取溶劑，超聲功率200 W，提取時(shí)間為30 min，液料比為20 mL ∶1 g、30 mL ∶1 g、40 mL ∶1 g、50 mL ∶1 g、60 mL ∶1 g等5個(gè)水平進(jìn)行研究，以探索液料比對(duì)油茶殼總黃酮提取效果的影響。

1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)[14-15]根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定超聲功率、乙醇濃度、提取時(shí)間為主要影響因素，以油茶殼總黃酮溶出率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行3因素3水平響應(yīng)面分析。試驗(yàn)設(shè)計(jì)的水平及編碼見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平編碼

1.4 總黃酮溶出率[16-17]

1.5 油茶殼總黃酮的抑菌活性[18]

分別將枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌進(jìn)行接種活化，用無(wú)菌水制成一定濃度的細(xì)菌懸浮液，稀釋備用。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素對(duì)黃酮超聲提取率的影響

2.1.1 超聲功率的影響 在其他提取工藝條件一定時(shí)，考察超聲功率對(duì)黃酮超聲提取效果的影響。由圖1可知，當(dāng)超聲功率為250 W時(shí)，總黃酮提取效果最好，但當(dāng)功率再增大時(shí)提取效果反而下降，這可能是由于當(dāng)功率增大到一定程度時(shí)，生成的黃酮類(lèi)化合物會(huì)被再水解成其他的物質(zhì)或是功率過(guò)大會(huì)對(duì)黃酮分子產(chǎn)生破壞作用。說(shuō)明超聲功率對(duì)總黃酮溶出率的影響是雙向性的，既有正效應(yīng)又有負(fù)效應(yīng)，試驗(yàn)中應(yīng)避免超聲功率過(guò)大而引起提取率下降。綜合考慮后，選擇功率為200、250、300 W繼續(xù)對(duì)油茶殼總黃酮超聲提取作響應(yīng)面分析，以確定最佳的超聲功率。

2.1.2 乙醇濃度的影響 在其他提取工藝條件一定時(shí)，考察乙醇濃度對(duì)黃酮超聲提取效果的影響。由圖2可知，總黃酮的提取效果隨著乙醇濃度的升高而增大，而后又變小。當(dāng)乙醇濃度為40%時(shí)，總黃酮的提取效果最好。根據(jù)相似相溶原理，極性相似可達(dá)到最大溶出度，即油茶殼總黃酮與40%乙醇極性相似。綜合考慮后，選擇乙醇濃度為30%、40%、50%繼續(xù)對(duì)油茶殼總黃酮超聲提取作響應(yīng)面分析，以確定最佳的乙醇濃度。

2.1.3 提取時(shí)間的影響 在其他提取工藝條件一定時(shí)，考察提取時(shí)間對(duì)黃酮超聲提取效果的影響。由圖3可知，開(kāi)始時(shí)總黃酮提取效果隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，提取時(shí)間達(dá)到60 min時(shí)，總黃酮提取效果最佳，之后總黃酮提取效果有所下降。分析其原因可能是由于時(shí)間過(guò)短產(chǎn)物溶出不充分，而提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，超聲波對(duì)總黃酮的提取結(jié)果有所破壞，引起產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的分解而使提取效果下降。綜合考慮后， 選擇提取時(shí)間為50、60、70 min繼續(xù)對(duì)油茶殼總黃酮超聲提取作響應(yīng)面分析，以確定最佳的提取時(shí)間。

2.1.4 液料比的影響 在其他提取工藝條件一定時(shí)，考察液料比對(duì)黃酮超聲提取效果的影響。由圖4可知，總黃酮提取效果隨著液料比的增大而增大，當(dāng)液料比到達(dá)40 mL ∶1 g時(shí)，吸光度達(dá)到最高值，隨后呈下降趨勢(shì)。從整體提取率上看，不同液料比的溶出率差別并不多。綜合考慮后，液料比不作為響應(yīng)面法的主要影響因素。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化油茶殼黃酮提取工藝條件

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果 根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，同時(shí)綜合考慮單因素試驗(yàn)分析結(jié)果，確定超聲功率、乙醇濃度、提取時(shí)間3個(gè)因素為總黃酮溶出率的顯著影響因素，以油茶殼總黃酮溶出率為響應(yīng)值(Y)，設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，其響應(yīng)面分析方案及結(jié)果見(jiàn)表2。

采用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表2中的各組數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面回歸后擬合方程，得Y=2.28+0.049A+0.075B-0.029C+7.5×10-3AB-0.019AC+8.175×10-3BC-0.34A2-0.53B2-0.078C2，并進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。其中，Y為油茶殼總黃酮含量的預(yù)測(cè)值；A、B、C分別為上述超聲功率、乙醇濃度、提取時(shí)間的編碼值。

表2 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果

表3 回歸方程方差分析結(jié)果

2.2.2 各因素之間的交互作用 用Design-Expert 8.0.6軟件處理的響應(yīng)面分析結(jié)果見(jiàn)圖5至圖7。

通過(guò)Design-Expert8.0.6軟件分析，將3因素互相進(jìn)行分析比較，作出響應(yīng)面曲線圖。等高線即為響應(yīng)面圖在底面的投影，其形狀反映了交互影響的強(qiáng)弱。等高線趨于圓形時(shí)，2因素的交互作用相對(duì)較弱；等高線呈橢圓形時(shí)，2因素的交互作用相對(duì)較強(qiáng)。由圖5至圖7可知，超聲功率和乙醇濃度的等高線、超聲功率和提取時(shí)間的等高線、乙醇濃度和提取時(shí)間的等高線均為圓形，說(shuō)明它們之間的交互作用不明顯。

利用Design-Expert 8.0.6軟件分析所得回歸模型方程，得到最佳提取工藝：超聲功率為253.94 W，乙醇濃度為 40.7%，提取時(shí)間為58.07 min。但考慮到實(shí)際情況，將最佳提取工藝條件參數(shù)修正為超聲功率為255 W，乙醇濃度為41%，提取時(shí)間為58 min。為檢驗(yàn)響應(yīng)面法優(yōu)化結(jié)果的可靠性，采用修正的最佳提取條件，經(jīng)過(guò)3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到油茶殼總黃酮溶出率為2.652 3%，為試驗(yàn)中最大值，同時(shí)該試驗(yàn)值與預(yù)期值吻合良好。

2.3 油茶殼總黃酮的抑菌活性

由表4可知，油茶殼總黃酮提取物對(duì)試驗(yàn)菌種枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌均有明顯抑制作用，并且抑菌效果為金黃色葡萄球菌>枯草芽孢桿菌>大腸桿菌。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)利用酶解-超聲波法提取油茶殼總黃酮，通過(guò)單因素試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，超聲功率、乙醇濃度、超聲時(shí)間、液料比等4個(gè)因素均對(duì)總黃酮溶出率有一定程度的影響。通過(guò)篩選確定超聲功率、乙醇濃度、超聲時(shí)間為主要影響因素。通過(guò)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)建立提取油茶殼總黃酮的優(yōu)化回歸方程模型，經(jīng)過(guò)方差分析該模型與實(shí)際試驗(yàn)擬合良好。因變量與自變量之間具有顯著線性關(guān)系，可以替代試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。最佳提取工藝條件：超聲功率為255 W，乙醇濃度為41%，提取時(shí)間為58 min。驗(yàn)證試驗(yàn)得到油茶殼總黃酮溶出率為2.652 3%，為試驗(yàn)中的最大值，同時(shí)該試驗(yàn)值與預(yù)期值吻合良好。油茶殼總黃酮提取物有抑菌活性，對(duì)枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌抑制作用明顯。

表4 油茶殼總黃酮的抑菌圈直徑