致病性熒光假單胞菌FK-1的分離鑒定及其感染草魚后免疫因子的變化研究

張志鵬， 王 會， 閻 華， 黃升謀， 李云捷， 吳進菊， 于 博， 李玉奇

(1.湖北文理學院化學工程與食品科學學院，湖北襄陽 441053； 2.湖北省襄陽市中心醫院，湖北襄陽 441053)

草魚屬鯉形目鯉科雅羅魚亞科草魚屬，棲息于平原地區的江河湖泊，一般喜居于水的中下層和近岸多水草區域，性活潑，游泳迅速，常成群覓食，為典型的草食性魚類。草魚幼魚期擇食幼蟲、藻類等，草魚也吃一些葷食，如蚯蚓、蜻蜓等。在干流或湖泊的深水處越冬，生殖季節親魚有溯游習性，因其生長迅速，飼料來源廣，是中國淡水養殖的四大家魚之一，分布于中國各大水系，肉味美、魚膽有毒。由于草魚的高密度養殖，高蛋白飼料投喂易造成水環境惡化，同時許多養殖場忽視了防病措施，傳染性疾病日趨嚴重，發病率高達70%以上，造成了極大的經濟損失。近期廣東地區一些養殖場暴發草魚疾病，其體表出現潰瘍，嚴重者口鼻充血、流血，解剖后內臟肝、脾、腎腫大。經過細菌分離鑒定是熒光假單胞菌的大量感染，熒光假單胞菌分類學上屬于細菌域、變形菌門、γ-變形菌綱、假單胞菌目、假單胞菌科的假單胞菌屬。細胞為直的桿菌，不產芽孢，革蘭氏染色陰性，有數根極生鞭毛，運動；需氧，進行嚴格的呼吸型代謝，以氧為最終電子受體，能以硝酸鹽為替代的電子受體進行厭氧呼吸；化能營養異養，不需要有機生長因子；氧化酶陽性，接觸酶陽性。能利用葡萄糖和果糖，有些菌株能從蔗糖合成果聚糖[1]。廣泛分布于自然界，如土壤、水、植物及動物活動環境中。草魚血液中鐵元素參與諸多代謝途徑，也是免疫系統發揮作用的重要因子，可影響巨噬細胞的殺菌功能以及免疫細胞的增殖和活性。同時，鐵元素也是病原微生物和宿主相互競爭的對象，機體可以通過調節鐵元素相關基因，一定程度上抑制病原微生物的侵害。Hepcidin基因(hepc)是一種主要由肝細胞產生的防御性抗菌肽，屬于防御素蛋白家族，具有抑菌活性，同時也是機體鐵元素代謝的關鍵調節因子，對維持鐵元素平衡具有重要作用，俗稱鐵調素[2]。白細胞介素6(il-6)炎癥因子能強烈地刺激鐵調素的表達，而il-6炎性因子是通過刺激JAK/STAT(蛋白酪氨酸激酶/信號轉導和轉錄激活子)信號通路調節鐵調素表達[3]。本試驗通過草魚源熒光假單胞菌FK-1的分離鑒定，進而檢測侵染熒光假單胞菌FK-1后對草魚鐵元素代謝水平和肝臟中hepc、il-6、jak3和stat3基因表達量變化趨勢，研究熒光假單胞菌FK-1侵染和機體鐵元素代謝之間的相互作用，為進一步研究鐵元素相關基因在受感染草魚應對細菌侵染中的作用提供科學研究基礎。

1 材料與方法

1.1 染病草魚采集與病原菌的分離

2016年8月，廣東省佛山市順德區大良鎮某漁場草魚暴發疾病，出現大量死魚。人工收集染病草魚，肉眼觀察這些死魚患典型敗血癥，其主要癥狀為口鼻充血、出血，魚鱗片出現脫落、有血絲。將死魚低溫冷藏運回廣東省農業科學院動物科學研究所水產實驗室，解剖后可見死魚肝臟腫大、點狀出血、腎臟和腸道充血。在無菌條件下，從染病草魚的肝、腎、皮膚、血液取樣，營養瓊脂平板劃線分離，30 ℃培養24 h，挑取單菌落純化培養，菌株低溫保存備用。

1.2 細菌鑒定

經細菌形狀、革蘭氏染色和氧化酶檢測，采用法國梅里埃生物公司革蘭氏陰性或陽性鑒定試劑條，VITEK-32全自動細菌鑒定儀鑒定[4]。

1.3 試驗用健康草魚

試驗用健康草魚，購自廣東省農業科學院水產養殖基地，選取外觀健康、大小基本一致的草魚幼魚，魚體質量為(200±5) g、體長為(25±1) cm。將試驗魚隨機分為2個處理組：試驗組和對照組，每個處理組設3個平行，每個平行組50尾魚，共300尾。

1.4 熒光假單胞菌FK-1侵染和樣品采集

根據前期試驗，確定熒光假單胞菌FK-1侵染的最適菌懸液濃度為 1.0×107CFU/mL。將30 ℃恒溫過夜培養的熒光假單胞菌FK-1用0.65%無菌生理鹽水洗脫，稀釋成 1.0×107CFU/mL 的菌懸液，采用腹腔注射法，注射前試驗魚用200 mg/L乙醇輕度麻痹，試驗組每尾注射0.1 mL的菌懸液，對照組注射等量的無菌生理鹽水。注射后6、12、24、48、72、84、96 h分別采集試驗組和對照組魚的肝臟和機體，每個時間點每個平行取3尾魚，將一次性1 mL注射器用肝素鈉(1 000 IU/mL)潤洗，從魚體尾靜脈取血0.5～0.8 mL。采血后立即解剖，取出肝臟組織置于液氮中，之后于-80 ℃保存，用于后面的肝臟鐵含量和基因表達測定。

1.5 血清鐵濃度、總鐵結合力的測定

血清樣品制備：采取的血液于40 ℃靜置2 h左右，以 4 000 r/min 離心10 min后收集上層血清，-20 ℃冰箱過夜，次日血清解凍后再次低速度離心，4 000 r/min離心10 min，吸取上層液-80 ℃保存備用。

血清鐵濃度及總鐵結合力(mg/L)的測定使用血清鐵、總鐵結合力試劑盒(深圳市紅瑞生物工程有限公司)。血清鐵濃度的檢測原理為，在酸性溶液和還原劑的作用下，使轉鐵蛋白中鐵與蛋白分離，使血清中高鐵還原成亞鐵，后者與雙吡啶結合成粉紅色的絡合物，在一定范圍內，鐵離子的濃度與吸光度成正比。總鐵結合力的檢測原理為[4]，血清內加入過量的鐵，使血清中轉鐵蛋白全部與鐵結合，再加入鐵吸附劑將多余的鐵吸附掉。然后依據血清鐵檢測方法測定鐵含量，即總鐵結合力。測定步驟具體參照試劑盒說明書，利用紫外分光光度計(TU-1900，北京普析通用儀器有限公司)測定，每一樣品重復檢測3次。

1.6 肝臟鐵濃度的測定

采用電感耦合等離子發射光譜儀(ICP-AES)檢測肝臟鐵含量[5]，步驟如下：將肝臟樣品解凍后，用冷生理鹽水沖洗干凈并用濾紙吸干后稱質量，粉碎均勻后置于瓷坩鍋中，在電爐上炭化完全，無煙為止，置于馬弗爐內，經600 ℃灼燒5 h，直至試樣呈白色或者灰白色、無炭粒為止。冷卻后取出，用 1 ∶1 的硝酸5 mL溶解，電爐上加熱直至沸騰為止，過濾至 50 mL 容量瓶，并用雙蒸水反復洗滌坩堝和濾紙，洗滌液并入容量瓶中，然后用雙蒸水定容，混勻，作為試樣溶液。同時配制試劑空白液。采用ICP-AES儀(ICP-3600，上海精密科學儀器有限公司)測定，每一樣品重復檢測3次。

1.7 肝臟鐵代謝相關基因表達特征分析

根據草魚hepc基因cDNA序列(FC398254)、il-6基因cDNA序列(KL734254)，jak3基因cDNA序列(LQ543282)、草魚stat3基因cDNA序列(NM916923)設計引物(表2)[6-8]。采用RNAiso(大連寶生物工程有限公司)提取肝臟總RNA，反轉錄成cDNA，根據說明書在實時定量儀(T-100，美國伯樂儀器有限公司)上進行實時熒光定量PCR。目的基因在肝臟中的相對表達量采用2分對照法確定，選擇草魚18S rRNA基因作為內參(BF264255)[9]。實時熒光定量PCR反應體系：0.4 μL上下游引物，2.0 μL cDNA模板，7.2 μL ddH2O，總體積20 μL。反應條件為：95 ℃預變性1 min；95 ℃變性 5 s，60 ℃退火20 s，72℃延伸20 s，35個循環，溶解曲線溫度從52 ℃至99℃，每一樣品重復檢測3次。

表2 草魚鐵代謝相關基因熒光定量PCR引物序列

1.8 數據分析

所有數據利用SPSS 18.0軟件進行統計分析，采用t-檢驗法進行差異顯著性分析，P<0.05表示差異顯著[10]。所有數值均為“平均值±標準差”。

2 結果與分析

2.1 菌落特征

從染病草魚肝臟中分離出1株菌株FK-1，24 h營養瓊脂平板培養物為黃色、濕潤圓形略隆起、邊緣整齊，直徑2 mm左右，革蘭色染色為陰性桿菌(圖1)。

2.2 生化反應及鑒定結果

菌株FK-1經純化分離后，采用VITEK-32全自動微生物鑒定儀鑒定結果為熒光假單胞菌，其生理、生化特性見表3。

2.3 熒光假單胞菌FK-1侵染草魚后其血清鐵濃度變化

熒光假單胞菌FK-1侵染草魚后不同時間點血清中鐵濃度的變化趨勢見圖2。細菌侵染后不同時間點試驗組草魚的血清鐵濃度與對照組相比均有不同程度降低，侵染后 24 h 和48 h后達到顯著水平(P<0.05〉，隨后血清鐵濃度有所上升，但仍低于對照組。

表3 菌株FK-1生理生化特性

2.4 熒光假單胞菌FK-1侵染草魚后對其血清總鐵結合力的變化

熒光假單胞菌FK-1侵染草魚后不同時間點其血清中總鐵結合力的變化趨勢見圖3。試驗組草魚血液中血清的總鐵結合力相對于對照組略有增加，但均未達到顯著性水平。

2.5 熒光假單胞菌FK-1侵染草魚后其不同時間點肝臟鐵含量的變化

由圖4可見，熒光假單胞菌FK-1侵染草魚后不同時間點試驗組肝臟鐵含量均高于對照組，但并無顯著性差異(P>0.05)。

2.6 熒光假單胞菌FK-1侵染草魚后對其不同時間點hepc、il-6、jak3、stat3基因表達的影響

由圖5可見，在注射熒光假單胞菌FK-1后，hepc基因在不同時間點表達量相對于0 h明顯上調，在6、12、24 h達到顯著性差異(P<0.05)，在侵染后6 h達到最高，隨后逐漸下降。基因il-6在侵染后表達量明顯上調，在24 h時表達量最高，隨后有所下降，在12、24、48 h均達到了顯著性差異(P<0.05)；基因jak3和stat3的表達量亦均有所上調，jak3基因在12 h時表達量達到最高(P<0.05)，stat3基因在6 h時的表達量達到最高，隨后逐步下降，但仍明顯高于侵染前的表達水平。

3 討論

從染病草魚中取樣進行細菌的劃線分離、純化，在營養瓊脂平板上獲得菌落形態完全一致、有典型致病力的菌株，將該菌株編號為FK-1。全自動細菌鑒定儀鑒定結果為嗜溫熒光假單胞菌。菌株FK-1人工感染草魚試驗，出現的癥狀與自然病例基本相同，再鑒定的菌株與接種菌株完全一致，所觀察到的菌落形態也基本相符。該菌能廣泛地侵襲健康草魚腎、脾、肺、肝、肌肉和血液等器官組織，大量增殖，造成廣泛性出血，全身性組織損害，各器官組織出現腫脹、顆粒變性、玻璃樣變、壞死崩解以及紅細胞碎裂。染病草魚解剖后觀察均可見體表出現潰瘍、疤痕，嚴重的產生口鼻充血、流血，內臟肝、脾、腎腫大，腸道充血，嚴重者有腹水。

草魚血液中鐵元素是機體多種酶類合成的必需元素，參與氧氣運輸、細胞增殖和分化、電子轉移等多種生命活動。鐵元素也是需鐵細菌增殖分化的必要成分，并且對致病菌毒力的強弱也會產生重要影響。細菌入侵后通過攝取宿主機體的鐵元素以滿足其增殖和致病力的表達。宿主通過降低機體的鐵元素代謝水平，在一定程度上可以抑制細菌增殖并降低其致病力。本試驗結果表明，草魚感染熒光假單胞菌FK-1后血清鐵元素含量有所下降，并在侵染后24、48 h達到顯著性水平。肝臟鐵含量在侵染后有所上升，但沒有達到顯著性水平。這可能與機體在侵染后通過一系列自我調節，降低機體的鐵元素代謝以抑制細菌的侵害以及細菌在機體迅速增殖消耗大量鐵元素有關。草魚感染熒光假單胞菌FK-1后的血清總鐵結合力相對于對照組有所上升，雖沒有達到顯著性水平，但結合細菌侵染后魚體血清鐵元素含量的變化趨勢和轉鐵蛋白的上調，可以認為血清鐵元素和轉鐵蛋白的比率顯著下降，進一步提高了鐵與轉鐵蛋白的結合效率，有利于抑制熒光假單胞菌FK-1從機體攝取鐵元素的能力。

本試驗中所檢測的草魚肝臟hepc、il-6、jak3和stat3基因在熒光假單胞菌FK-1侵染后6、12 h都有不同程度的顯著上調，表明這些基因都參與了魚體的非特異性免疫反應，同時這些基因也不同程度地參與了細菌侵染后的鐵元素相關基因調節。hepc基因主要在肝臟中合成和分泌，可以抑制腸道鐵元素的吸收和肝臟鐵元素的釋放以降低機體的鐵元素相關基因水平，是機體調節鐵相關基因的關鍵因素。前人研究證實，大菱鲆在感染細菌熒光假單胞菌FK-1后，肝、脾、鰓等組織中hepc基因的表達量均顯著增高。感染鏈球菌后，鱸魚肝細胞hepcmRNA水平在數小時內明顯上調。鯽魚肝臟中hepc基因表達量在感染鰻利斯頓氏菌后顯著上升[11-12]。本試驗中，hepc基因在侵染后不同時間點的表達量均有所上升，并在12、24 h達顯著差異。草魚機體受熒光假單胞菌侵害時，巨噬細胞等免疫細胞會合成和分泌大量的炎癥因子，其中主要為白細胞介素6(il-6)，炎癥反應可通過一系列生化過程調節hepc基因的表達，進而影響機體鐵元素相關基因水平。il-6和受體結合后可激活jak3基因，進而磷酸化stat3，進入細胞核，調節hepc基因的轉錄，促進hepc基因的表達。本試驗中，在草魚感染熒光假單胞菌FK-1后各時間點草魚肝臟中il-6的表達量均有所上升，在24 h達到最高，隨后有所下降，但仍明顯高于0 h的表達量。基因jak3和stat3的表達量也均有所上調，分別在6、12 h達到最高，隨后有所下降，可以推測，當熒光假單胞菌FK-1侵染草魚時，引起機體發生炎癥反應，在il-6基因和JAK/STAT通路相關基因的影響下，hepc基因的表達量上升，進而下調機體的循環鐵元素濃度，以應對細菌的侵害。