復合微生物肥料功能菌的篩選及其對黃瓜幼苗的促生作用

王巧玲， 范廣璞， 楊 猛， 許楠楠

(江蘇食品藥品職業技術學院，江蘇淮安 223003)

近年來，全世界農藥化肥使用量的不斷增加，造成了土壤板結、河流和地下水污染等一系列問題。我國作為農業大國，對農藥、化肥的依賴性較強，在使用農藥防治病蟲草害的同時，常產生糧食、蔬菜等農產品中農藥殘留超標的問題，且多數農藥不易被生物降解，對人類及其他生物產生毒害。大量研究表明，微生物肥料的開發與應用對創造良好的生態環境、改善土壤結構、提高土壤肥力及減少農藥污染等具有重要作用，是農藥和化肥的有效替代品[1]。

微生物肥料是指一種以活性微生物為主的特定菌劑，能夠通過微生物的生命活動，產生農作物所需的特定肥料，并促進土壤中的物質轉化，刺激和調控作物的生長，防治作物的病蟲害，降解農藥，從而達到植物增產、減輕化學污染的目的[2]。微生物肥料的核心是微生物，具有微生物的特性，其降解農藥的機制主要分為2種：一種是通過酶促反應直接降解農藥；另一種是通過改變化學和物理環境間接作用于農藥[3]。目前微生物肥料多采用多種菌株復合的方式充分發揮各菌株的作用，從而提高微生物肥料的效力[4]。本研究從農藥污染的土壤中篩選出具有固氮、解有機磷農藥、解有機氯農藥的菌株，經鑒定后進行黃瓜幼苗的促生長試驗，為實際應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養基 LB培養基[5]： 蛋白胨1.00 g，酵母粉0.50 g，NaCl 1.00 g，H2O 100 mL，(固體)瓊脂15 g/L。Ashby無氮培養基[6]：KH2PO40.03 g，CaCO30.50 g，MgSO4·7H2O 0.03 g，甘露醇1.00 g，NaCl 0.30 g，(固體)瓊脂1.50 g，CaSO40.01 g，去離子水100 mL。液體選擇培養基：普通LB培養基滅菌后冷卻至50 ℃，加入1 g/L有機磷農藥或1 g/L有機氯農藥。固體選擇培養基：普通LB固體培養基滅菌后冷卻至50 ℃，加入1 g/L有機磷農藥或1 g/L有機氯農藥。

1.1.2 試劑 氧樂果、2，4-D，均購自江蘇揚農化工集團有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 采樣地點為江蘇省蘇北地區某農藥生產企業周邊農田。采樣方法：取地表及地表下5～10 cm處的土樣1 kg左右，裝于預先滅菌的袋子中，扎緊。

1.2.2 土壤懸液的制備 稱取10 g土壤樣本溶于90 mL無菌水中，充分振蕩，將土壤懸液按10倍梯度逐步稀釋，制成10-1～10-7土壤稀釋液。

1.2.3 功能 菌株的初步分離與篩選取0.1 mL 10-3～10-7土壤稀釋液，依次均勻涂布到Ashby培養基、有機磷農藥培養基、有機氯農藥培養基上，30 ℃培養7 d，觀察生長情況并選取透明圈較大的單菌落，多次傳代培養后取長勢較好的菌株保存。

1.2.4 功能菌株的復篩

1.2.4.1 固氮菌株的復篩 采用乙炔還原法[7]測定固氮菌株的固氮酶活性，篩選出固氮能力較強的菌株。首先將初篩獲得的菌株分別接種于4.5 mL Ashby無氮培養基中，28 ℃培養48 h后，從試管中抽出1.8 mL氣體，然后注入1.6 mL C2H2(對照管除外)，再于培養箱中培養48 h后，從試管中抽取 0.5 mL 混合氣體注入氣相色譜儀中，測定C2H2、C2H4的生成情況。根據C2H4峰值判斷C2H4的產生情況，以接種菌株但未注入C2H2的試管作為對照組，重復5次。固氮酶活性計算公式如下：

N=(hx×C×V)/(hs×常數×t)。

式中：hx為樣品峰值；hs為標準C2H4峰值；C為標準C2H4濃度，nmol/mL；V為試管體積，mL；常數為標準C2H4測試時的體積，mL；t為樣品培養時間，h；N為產生的C2H4濃度，即固氮酶活性，nmol/(h·mL)。

1.2.4.2 有機磷農藥降解菌的復篩 將初篩獲得的菌株接種至加入有機磷農藥的液體選擇培養基中，以不接種菌的空液體選擇培養基作為對照，重復5次，37 ℃振蕩培養72 h后，采用分光光度法[8]分別測定培養前后培養液中有機磷含量，考察各菌株對有機磷農藥的降解能力。有機磷農藥降解率計算公式如下：

降解率=(C1-C2)/C1×100%。

式中：C1為培養前有機磷濃度，nmol/mL；C2為培養后有機磷濃度，nmol/mL。

1.2.4.3 有機氯農藥降解菌的復篩 將初篩獲得的菌株接種至溴甲酚紫培養基中，以不接種菌株的培養液作為對照，重復5次，30 ℃振蕩培養，當培養液由紫色變為黃色時，停止培養[9]。將培養液于4 000 r/min離心20 min，取上清，采用分光光度法于283 nm處測定吸光度，并計算有機氯農藥的降解率，通過比較篩選出降解力最強的菌株。有機氯農藥降解率計算公式如下：

降解率=(L1-L2)/L1×100%。

式中：L1為培養前有機氯濃度，nmol/mL；L2為培養后有機氯含量，nmol/mL。

1.2.4.4 拮抗病原菌能力測定 采用平板對峙法[10]測定菌株與病原菌的拮抗作用。將菌株接種到LB液體培養基中，于150 r/min振蕩培養48 h。再將黃瓜枯萎病病菌、黃瓜褐斑病病菌接種到PDA平板中心(病原菌菌餅直徑為5～6 mm)，距中心約為3 cm，滴加菌株懸液，28 ℃培養3～5 d。記錄病原菌的菌落半徑(R)、病原菌點樣中心點到被復篩菌株抑制邊緣的半徑(r)，按下式計算抑制率：

抑制率=(R-r)/R×100%。

1.2.4.5 菌株拮抗性試驗 對篩選出的菌株進行拮抗性試驗，將無拮抗反應的菌株進行組合，作為復合微生物肥料的功能菌株。

1.2.5 菌種鑒定

1.2.5.1 菌株形態特征和生理生化特性 根據《常見細菌系統鑒定手冊》[11]對篩選所得菌株的菌落特征、菌體形態進行觀察，對菌落的染色性及生理生化特性進行研究，獲得鑒定結果。

1.2.5.2 菌株的分子鑒定 用細菌基因組DNA快速抽提試劑盒提取出復篩菌株的基因組DNA，采用PCR擴增16S rDNA的方法對復篩菌株進行分子鑒定。設計的上游引物序列為5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG- 3′，下游引物序列為5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。反應體系：10×Buffer 5 μL、dNTP mix 4 μL、Taq酶0.3 μL、cDNA2 μL、引物1 μL、ddH2O 37 μL。PCR擴增條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30個循環；72 ℃延伸10 min。獲得的產物采用PCR產物純化試劑盒進行純化，純化后的產物用2%瓊脂糖凝膠電泳進行驗證，并送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序，將測序結果與序列庫進行比對并構建系統發育樹。

1.2.6 盆栽試驗 選取顆粒飽滿均勻的黃瓜種子，用蒸餾水洗凈并浸泡一段時間后，用75%乙醇浸泡1 min、5%次氯酸鈉浸泡3 min，每次浸泡后均用無菌水沖洗5～6次，進行種子表面消毒。將消毒后的黃瓜種子置于培養皿中，于暗處催芽 2 d。催芽后播種于育苗盤，待幼苗長出2～3張真葉后，挑選大小、長勢一致的幼苗移入含有有機磷和有機氯農藥的滅菌栽培基質的塑料盆中。將供試菌株接種于LB液體培養基中，于28 ℃、160 r/min振蕩培養至對數期，將菌懸液用PBS(磷酸緩沖鹽溶液)洗滌2～3次后稀釋至菌液濃度約為 108CFU/g。分別取稀釋后的菌懸液5 mL澆灌于幼苗根部，每10 d接種1次，以加入等量無菌水為對照，每組6次重復。放置于溫室中培養30 d后，將作物整株從盆中取出，用清水洗凈，吸水紙吸干，測量各試驗組和對照組的各種形態學參數。

1.2.7 數據處理 各組所得計量數據采用均值±標準差的方式表示，使用統計軟件進行統計分析并作圖，P<0.05表示有顯著差異，P<0.01表示有極顯著差異。

2 結果與分析

2.1 功能菌株的初篩結果

在Ashby培養基、有機磷農藥培養基、有機氯農藥培養基上均勻涂布土壤稀釋液，于30 ℃培養7 d后，根據其長勢和透明圈的大小分別挑選出固氮菌株8株(GN1～GN8)、有機磷農藥降解菌株8株(JP1～JP8)、有機氯農藥降解菌株8株(JL1-JL8)。

2.2 功能菌株的復篩結果

2.2.1 固氮菌株 復篩試驗為篩選出固氮能力較強的菌株，采用乙炔還原法測定初篩獲得的菌株的固氮酶活性。圖1表明，8株自生固氮菌的固氮酶活性介于55.41～126.17 nmol/(h·mL)，將固氮菌株按照固氮酶活性的高低進行排序可得：GN4>GN6>GN7>GN5>GN3>GN1>GN2、GN8，其中GN4、GN6、GN7的固氮酶活性均高于 100 nmol/(h·mL)，因此選取GN4、GN6、GN7菌株與病原菌進行拮抗性試驗。

2.2.2 有機磷農藥降解菌 復篩試驗為獲得有機磷農藥降解率較高的菌株，將初篩獲得的菌株接種至加入有機磷農藥的液體選擇培養基中進行培養，采用分光光度法分別測定培養前后培養液中的有機磷含量，考察各菌株對有機磷農藥的降解能力。圖2顯示，8株菌株的有機磷農藥降解率介于34.93%～66.18%之間，且與對照組相比有極顯著差異(P<0.01)，其中菌株JP3的有機磷農藥降解率最高，為66.18%，JP8、JP2的有機磷農藥降解率次之，分別為64.03%、55.94%，因此選取菌株JP3、JP8、JP2與病原菌進行拮抗性試驗。

2.2.3 有機氯農藥降解菌 復篩采用分光光度法對初篩的有機氯農藥降解菌株的降解率進行測定，結果(圖3)表明，8株菌株的有機氯農藥降解率介于38.44%～74.86%之間，其中降解率最高的是JC7菌株，為74.86%，其次是JC3、JC1，各組與對照組相比均有極顯著差異(P<0.01)，因此篩選菌株JC7、JC3和JC1進行病原菌拮抗性試驗。

2.2.4 病原菌拮抗性測定結果 將篩選出的9株菌株分別與黃瓜枯萎病病菌、黃瓜褐斑病病菌進行拮抗作用試驗，由表1可知，對2種病原菌均有抑制能力的菌株為GN6、JP2、JC7、JC1。

表1 各菌株對病原菌的拮抗率

2.2.5 菌株拮抗性試驗 對篩選出的GN6、JP2、JC7、JC1進行菌株間拮抗性試驗，發現GN6、JP2、JC1之間無相互拮抗作用，而JC7和GN6、JP2有拮抗現象，因此最終篩選出GN6、JP2、JC1作為復合微生物肥料的有效菌株。

2.3 菌種鑒定

2.3.1 菌株形態特征和生理生化特性測定 通過對3個菌株的菌落形態特征觀察發現，GN6、JP2、JC1菌落均為乳白色，邊緣不整齊(表2)。顯微結構觀察顯示，3株菌株均為桿狀，GN6為革蘭氏陰性菌，不產芽孢，JP2和JC1為革蘭氏陽性菌，芽孢中生或次端生。生理生化試驗結果顯示，GN6能發酵葡萄糖、液化明膠、利用甘露醇，吲哚、甲基紅試驗呈陰性，不能利用檸檬酸，接觸酶、氧化酶、過氧化氫酶試驗均為陽性。JP2和JC1能發酵葡萄糖、水解淀粉、液化明膠、利用甘露醇和檸檬酸鹽，吲哚試驗、氧化酶試驗為陰性，JC1的V-P試驗呈陰性，其他反應均為陽性。

表2 菌株菌落形態特征及部分生理生化特征

注：“+”“-”分別表示相應反應呈陽性、陰性。

2.3.2 菌株的分子鑒定 將GN6、JP2、JC1菌株的16S rDNA基因序列經Blast比對分析發現，GN6與假單胞菌K32(Pseudomonassp.)的同源性高達100%，JP2與芽孢桿菌 TU-10(Bacillussp.)的同源性高達98%，JC1與芽孢桿菌BSn5(Bacillussp.)的同源性高達98%，根據序列比對結果構建系統進化樹(圖4)。結合3株菌株的菌落形態、生理生化特性初步確定，GN6屬于假單胞菌屬(Pseudomonassp.)，JP2、JC1屬于芽孢桿菌屬(Bacillussp.)。

2.4 盆栽試驗結果

將菌株GN6、JP2、JC1及3株菌株的混合菌液稀釋后接種于黃瓜幼苗根部，培養30 d后測量其株高和地上部干質量。由表3可以看出，接種GN6、JP2、JC1及3株菌株混合液后，黃瓜幼苗株高與對照組相比分別增加21.2%、11.4%、14.4%、31.8%，地上部干質量與對照組相比分別增加 16.3%、15.1%、17.9%、25.3%，且3株菌株混合接種處理后的株高和地上部干質量與單獨接種處理相比均顯著增高(P<0.05)。該結果表明，菌株GN6、JP2、JC1對于黃瓜幼苗的生長具有促進作用，且3株菌株混合后對于黃瓜幼苗的促生長作用更為明顯。

表3 各菌株對黃瓜幼苗的促生作用

注：a表示與對照組相比有顯著差異(P<0.05)；b表示混合菌液處理與單獨菌株處理相比有顯著差異(P<0.05)。

3 結論與討論

目前，微生物肥料已經成為農業科學的研究熱點之一[12-13]，而不同功能的多菌株組合是主要的研究方向和重點。根據不同微生物所具有的生化和功能特性，采用新的技術手段，將多種菌株進行科學合理的組合，排除菌株間的相互拮抗，發揮聯合菌株的共生協同作用，從而提高微生物肥料的功效，實現農作物的增產[14]。

本研究通過觀察菌株的透明圈大小初篩出固氮菌株、有機磷農藥降解菌株、有機氯農藥降解菌株各8株。根據其固氮能力、有機磷農藥降解能力和有機氯農藥降解能力復篩出9株菌株分別與黃瓜枯萎病病菌、黃瓜褐斑病病菌進行拮抗性試驗，篩選出GN6、JP2、JC7、JC1共4株菌株，最終通過菌株間的拮抗性試驗篩選出GN6、JP2、JC1作為復合微生物肥料的菌株。將3株菌株分別接種至黃瓜幼苗根部，30 d后黃瓜幼苗株高和地上部干質量均顯著高于對照組，而3株菌株混合液接種處理后的黃瓜幼苗株高和地上部干質量顯著高于單菌株處理組。

綜上所述，本研究篩選出的3株菌株對黃瓜幼苗的生長具有促生作用，可以作為復合微生物肥料的菌株，具有較大的應用潛力，對于黃瓜的大規模種植有一定的積極作用，同時可以修復被污染的土壤、改善土壤結構[15]。但是仍需要通過大田試驗作進一步的研究，其作用機制還需要進一步的探討。