外源噴施水楊酸對冬瓜枯萎病的防治效果及機制

李紅杰

(內蒙古農業大學職業技術學院，內蒙古包頭 014109)

冬瓜(BenincasahispidaCogn.)屬葫蘆科冬瓜屬一年生植物，原產于我國南部和印度，富含多種人體所必需的礦質元素和維生素，深受人們的喜愛，在我國已有2 000多年的栽培歷史[1-3]。近年來，隨著種植面積的不斷擴大和連作年限的延長，冬瓜病害問題日益頻發，尤其是冬瓜枯萎病的發生逐年加重，已成為我國冬瓜產業發展的主要障礙因素之一[4]。冬瓜枯萎病是一種由尖刀鐮孢菌冬瓜專化型(FusariumoxysporumSchl. f.sp.benincasae)引起的土傳性真菌病害，可在冬瓜整個生育期內進行危害，輕則造成減產，重則導致絕收，給農戶帶來巨大的經濟損失[5]。目前，前人在種質資源抗性評價[6]、抗性遺傳規律[7]、分子標記[8]及化學藥劑防治[9]等方面對冬瓜枯萎病展開了相應的研究，但是高抗枯萎病的冬瓜品種鮮見有相關報道，而化學藥劑的防治效果也不甚理想。因此，高效的生物防治藥劑開發已成為冬瓜生產中亟須解決的關鍵問題。水楊酸是植物體內的一類小分子酚類物質，具有植物內源信號分子功能，與植物的抗病性密切相關[10]。王錚等研究表明，外源噴施水楊酸可誘導煙草對斑萎病、花葉病、野火病及赤星病等產生抗性，可顯著減少農藥的使用量[11]；薛仁風等研究表明，水楊酸處理可誘導普通菜豆的苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase，簡稱PAL)活性、過氧化物酶活性、過氧化氫含量明顯升高，從而顯著提升普通菜豆對枯萎病的抗性[12]；石亞莉等研究表明，外源噴施水楊酸可顯著提升采后蘋果果肉組織的保護酶及病程相關蛋白活性，酚類及類黃酮物質明顯積累，從而提高了采后蘋果對灰霉病的抗性[13]。然而，關于水楊酸對冬瓜枯萎病的影響尚未見相關報道。因此，本研究以鐵柱999冬瓜品種為研究對象，研究外源噴施水楊酸對冬瓜枯萎病抗病性及相關生理生化指標變化的影響，初步探討水楊酸對冬瓜枯萎病的抗性誘導機制，以期為水楊酸在冬瓜枯萎病防治方面的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試冬瓜品種為鐵柱999，購自湖南省長沙市銀田蔬菜種子實業有限公司；供試冬瓜枯萎病病原菌尖刀鐮孢菌(FusariumoxysporumSchl.)由筆者所在實驗室自主分離、保存；供試水楊酸為分析純水楊酸，購自生工生物(上海)股份有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設計 2017年3月20日在內蒙古農業大學職業技術學院日光溫室內穴盤育苗。4月5日選取長勢一致的鐵柱999冬瓜幼苗150株，分別定植于40 cm×50 cm 的花盆中，栽培土壤為當地日光溫室普通土壤，每盆定植1株。試驗共設置5個處理，即在定植后分別用濃度為50、100、150、200 mg/L 的水楊酸溶液進行葉面噴施，每天噴施1次，10 mL/次，連續噴施3次，以噴施等量的無菌清水作為對照(CK)，每個處理10株，重復3次，共計150株。水楊酸連續3次噴施完成后，每株接種2.0×106CFU/g土的尖鐮孢菌。整個試驗期間，給予各植株正常的水肥管理。

1.2.2 項目測定及方法 冬瓜枯萎病發病情況于接種后5 d開始調查，每隔3 d調查1次，共調查6次，病情指數及防治效果計算按照趙仕光等的方法[14]進行。生理生化指標于接種前進行第1次測定，第2次于接種后5 d進行測定，之后每隔3 d測定1次，共測定6次。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，簡稱SOD)活性、多酚氧化酶(polyphenol oxidase，簡稱PPO)活性、過氧化氫酶(catalase，簡稱CAT)活性及PAL活性測定分別采用抑制硝基四氮唑(NBT)光還原比色法、三氯乙酸比色法、紫外分光光度法和苯丙氨酸比色法進行；幾丁質酶(chitinase，簡稱CHT)活性測定采用徐恩靜等的方法[15]；β-1，3-葡聚糖酶(β-1，3-glucan，簡稱GLU)活性測定采用蔣選利等的方法[16]；H2O2含量測定采用高錳酸鉀法；丙二醛(malonic dialdehyde，簡稱MDA)含量測定采用硫代巴比妥酸比色法。

1.2.3 數據分析 試驗數據的整理、計算及作圖采用Excel 2007軟件進行，用SPSS 18.0軟件進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 外源噴施水楊酸對冬瓜枯萎病的影響

由圖1-a可知，在整個試驗期間，5種處理的冬瓜枯萎病病情指數均隨著時間的延長而逐漸升高。噴施相同時間時，150 mg/L外源水楊酸噴施處理的冬瓜病情指數始終最低，CK始終最高。在接種后20 d時，CK、50、100、150、200 mg/L 處理的病情指數分別達到62.15、42.05、35.18、28.25、31.33。假設CK對冬瓜枯萎病的防治效果為0，則4種不同濃度外源水楊酸噴施處理的防治效果依次為52.15%、60.16%、78.02%、67.78%。由圖1-b可知，150 mg/L 處理與50 mg/L處理達到極顯著差異水平(P<0.01)，與100 mg/L處理達到顯著差異水平(P<0.05)。上述結果表明，外源噴施水楊酸可明顯降低冬瓜枯萎病病情指數，提升枯萎病防治效果，其中以濃度 150 mg/L 噴施效果最佳。

2.2 外源噴施水楊酸對冬瓜葉片SOD、PPO、CAT及PAL活性的影響

由圖2可見，在接種枯萎病病原菌后，5種處理下的冬瓜葉片SOD、PPO及PAL活性均隨著時間的延長而表現為先升高后降低的趨勢。在整個試驗期間，150 mg/L外源水楊酸噴施處理下的SOD、PPO及PAL活性在同一時間點始終保持最高，并在接種后17 d活性達到最高，此時SOD活性分別較CK、50、100、200 mg/L處理提升82.33%、16.6%、10.25%、4.07%，PPO活性分別較CK、50、100、200 mg/L提升 73.22%、26.08%、15.07%、3.82%，PAL活性分別較CK、50、100、200 mg/L提升176.61%、28.06%、18.14%、6.03%，與CK及50 mg/L處理差異達到極顯著水平(P<0.01)，與 100 mg/L 處理差異達到顯著水平(P<0.05)。CAT活性在外源噴施水楊酸處理下表現為先降低后升高的趨勢，在整個試驗期間，150 mg/L外源水楊酸噴施處理下的CAT活性始終保持最低，并在接種后17 d達到最低，分別較CK、50、100、200 mg/L處理降低34.42%、25.96%、17.72%、8.98%，與CK及50 mg/L處理差異達到極顯著水平(P<0.01)，與 100 mg/L 處理差異達到顯著水平(P<0.05)。上述結果表明，外源噴施水楊酸可提升冬瓜葉片的SOD、PPO及PAL活性，降低CAT活性，以濃度150 mg/L處理效果最佳。

2.3 外源噴施水楊酸對冬瓜葉片CHT及GLU活性的影響

CHT和GLU是2個非常重要的病程相關蛋白，在植物抗病防御體系中發揮著非常重要的作用[17]。CHT屬于水解酶類，主要通過水解真菌菌絲合成的幾丁質抑制病原菌生長[17]。外源噴施水楊酸對冬瓜葉片CHT活性的影響如圖 3-a 所示，外源噴施水楊酸可明顯提升冬瓜葉片的CHT活性，且CHT活性隨著時間的延長表現為先升高后降低的趨勢。在整個試驗期間，150 mg/L外源水楊酸噴施處理下的CHT活性始終保持最高，并在接種后17 d達到最高，分別較CK、50、100、200 mg/L提升93.75%、14.72%、9.11%、4.75%，與CK及50 mg/L處理差異達到極顯著水平(P<0.01)，與 100 mg/L 處理差異達到顯著水平(P<0.05)。

GLU屬糖基水解酶類，不僅可以通過水解真菌細胞壁的主要成分β-1，3-葡聚糖而抑制真菌生長，而且可以間接誘導植物體內植保素的積累，從而提高植物抗病性[17]。由圖 3-b 可見，外源噴施水楊酸可提升冬瓜葉片的GLU活性，同時，GLU活性隨時間延長呈現先升高后降低的趨勢。150 mg/L 外源水楊酸噴施處理下的GLU活性在整個試驗期間始終保持最高，并在接種后17 d達到最高，分別較CK、50、100、200 mg/L提升254.57%、65.36%、47.62%、5.92%，與CK及50 mg/L處理差異達到極顯著水平(P<0.01)，與 100 mg/L 處理差異達到顯著水平(P<0.05)。上述結果表明，外源噴施水楊酸可提升冬瓜葉片的CHT及GLU活性，以濃度 150 mg/L 處理效果最佳。

2.4 外源噴施水楊酸對冬瓜葉片H2O2及MDA含量的影響

H2O2不僅是植物體內的活性氧，同時更是抗病反應中的重要信號分子，在植物抗病反應中發揮著重要作用[18]。由圖4-a可知，外源噴施水楊酸可促進H2O2在冬瓜葉片中的積累。在接種枯萎病病原菌后，5種處理下的冬瓜葉片中H2O2含量隨著時間的延長均表現為先升高后降低的趨勢。在整個試驗期間，150 mg/L外源水楊酸噴施處理下的H2O2含量始終保持最高，并在接種后17 d含量達到最高，分別較CK、50、100、200 mg/L提升44.08%、15.27%、10.11%、2.82%，與CK及50 mg/L處理差異達到極顯著水平(P<0.01)，與 100 mg/L 處理差異達到顯著水平(P<0.05)。說明，外源噴施水楊酸可促進H2O2在冬瓜葉片中的積累，以濃度 150 mg/L 噴施時H2O2含量最高。

MDA含量是衡量膜質過氧化程度的重要指標[19]。由圖4-b可見，外源噴施水楊酸可降低冬瓜葉片的MDA含量，且MDA含量隨時間的延長表現為逐漸增加的趨勢。150 mg/L外源水楊酸噴施處理下的MDA含量在整個試驗期間始終保持最低，在接種后20 d達到最高，MDA含量分別較CK、50、100、200 mg/L 降低37.3%、20.14%、13.24%、6.53%，與CK及50 mg/L處理差異達到極顯著水平(P<0.01)，與100 mg/L處理差異達到顯著水平(P<0.05)。上述結果表明，外源噴施水楊酸可降低冬瓜葉片中的MDA含量，以濃度150 mg/L噴施MDA含量最低，膜脂過氧化程度最輕。

3 結論與討論

水楊酸作為植物重要的內源信號分子，在植物抗病體系中發揮著重要的作用[10]。本研究結果表明，外源噴施水楊酸可降低冬瓜枯萎病病情指數，提升冬瓜枯萎病防治效果，且效果因噴施濃度大小而異， 以濃度150 mg/L噴施效果最佳， 冬瓜枯萎病防治效果達到78.02%。本研究結果與王錚等在煙草方面[11]、薛仁風等在普通菜豆方面[12]及石亞莉等在采后蘋果方面[13]的研究結果較為一致，可能是由于外源噴施水楊酸可提升植物的防御酶及病程相關蛋白酶活性，進而誘導植物產生抗病性。

植物自身擁有一套完整的防御酶系統，以抵御生物和非生物逆境對自身造成的傷害[18]。本研究結果表明，外源噴施水楊酸可提升冬瓜葉片的SOD、PPO及PAL活性，降低CAT活性。以濃度150 mg/L處理效果最優，接種后17 d冬瓜葉片的SOD、PPO及PAL活性分別較CK提升82.33%、73.22%、176.61%，CAT活性較CK降低34.42%，均達到極顯著差異水平(P<0.01)；本研究結果與王錚等在煙草方面[11]、薛仁風等在普通菜豆方面[12]及石亞莉等在采后蘋果方面[13]的研究結果較為一致。

CHT和GLU是2個非常重要的病程相關蛋白，在植物抗病防御體系中發揮著重要的作用[17]。本研究結果表明，外源噴施水楊酸可提升冬瓜葉片的CHT和GLU活性。在整個試驗期間，150 mg/L外源水楊酸噴施處理下的CHT及GLU活性始終保持最高，接種后17 d冬瓜葉片的CHT及GLU活性分別較CK提升93.75%、254.57%，均達到極顯著差異水平(P<0.01)，本研究結果與石亞莉等在采后蘋果方面的研究結果[13]較為一致。

H2O2是植物抗病反應中的重要信號分子，與植物抗病性密切相關[19-20]。本研究結果表明，外源噴施水楊酸可促進H2O2在冬瓜葉片中的積累。在整個試驗期間，150 mg/L外源水楊酸噴施處理下的H2O2含量始終保持最高，并在接種后17 d含量達到最高，較CK提升44.08%，達到極顯著差異水平(P<0.01)，本研究結果與苑智華在東方百合方面[21]、薛仁風等在普通菜豆方面[12]及馬玄等在杏方面[20]的研究結果較為一致，其原因可能是CAT是分解過氧化氫的關鍵酶，而外源噴施水楊酸可顯著降低植物的CAT活性，進而導致過氧化氫在植物體內積累，提高抗病性。

MDA含量是衡量膜脂過氧化程度的重要指標[19]。本研究結果表明，外源噴施水楊酸可降低冬瓜葉片的MDA含量，150 mg/L外源水楊酸噴施處理下的MDA含量在整個試驗期間始終保持最低，在接種后20 d MDA含量達到最高，較CK降低37.3%，達到極顯著差異水平(P<0.01)，其原因可能是150 mg/L外源水楊酸噴施處理下的冬瓜葉片防御酶活性最高，因此膜脂過氧化程度最輕，MDA含量最低。

綜上所述，外源噴施水楊酸可提升冬瓜對枯萎病的防治效果，以濃度150 mg/L處理效果最佳，其機制可能是外源噴施水楊酸可誘導冬瓜葉片的防御酶活性(SOD、PPO、PAL)和病程相關蛋白酶活性(CHT、GLU)上升，CAT活性降低，進而導致H2O2積累和膜脂過氧化程度降低，從而提升冬瓜枯萎病抗性。