纖維小體結構及其功能的研究進展

朱兆靜， 潘 虎， 郭 俊， 盧向陽， 王 翀， 田 云

(1.湖南省農業生物工程研究所，湖南長沙 410128； 2.湖南農業大學生物科學技術學院，湖南長沙 410128；3.西藏自治區農牧科學院農業質量標準與檢測研究所，西藏拉薩 850000)

纖維素作為植物細胞壁組分中的一種多糖物質，也是木質纖維素的重要組分之一，是目前地球上最豐富的可再生資源，開發利用價值極高，但由于與木質素相互摻雜，導致極難被降解，造成了纖維素資源的極大浪費[1]。纖維小體(cellulosome)一般由厭氧微生物產生，是由支架蛋白以及多種酶組裝成的大分子復合物，能夠高效地降解纖維素而引起廣泛關注。

Lamed等首次從超嗜熱厭氧微生物熱纖梭菌(Clostridiumthermocellum)中發現并鑒定了纖維小體復合體，分子大小為 2×106～6×106u，由14～50個亞基組成[2]。研究發現，纖維小體普遍存在于厭氧生物中，原因在于依靠高度組織化的細胞表面酶系統，調節細胞代謝活動，實現酶的再循環利用和水解產物的直接同化，抵抗厭氧發酵產能的不足[3]。厭氧真菌[梨囊鞭菌屬(Piromyces)、根囊鞭菌屬(Orpinomyces)和新美鞭菌屬(Neocallimastix)]中也有纖維小體復合物的存在，但真菌系統中缺乏真正的黏附結構域和錨定結構域，與細菌纖維小體有著明顯的不同[4]。

纖維小體降解纖維素的高效性取決于其高級結構的復雜程度，而不同微生物中的纖維小體結構組分和組裝模式具有明顯的不同，導致纖維素降解能力的差異[5]。此外，纖維小體在蛋白質等其他大分子的代謝以及細胞間的識別也發揮著一定的功能。本文根據最近的研究進展，對纖維小體的結構和功能進行了綜述。

1 纖維小體的結構

纖維小體一般是由2部分組成：一部分是含有錨定結構域(dockerin)的多酶亞基，有催化作用；另一部分是含有1個或多個黏附結構域(cohesin)的支架蛋白(scaffoldins)，有組裝作用[6]。纖維素酶通過錨定結構域與支架蛋白上的黏附結構域特異性結合，組裝成纖維素酶多酶復合體，其中支架蛋白上還含有1個纖維素結合域(CBM)，將底物纖維素結合于纖維素多酶復合體上。

1.1 支架蛋白

支架蛋白的種類和數量在不同物種中都有所不同，主要包括初級支架蛋白、錨定支架蛋白和銜接子支架蛋白(圖1-a)。根據支架蛋白的數量，可將纖維小體分為簡單纖維小體和高度結構化的纖維小體[7]。一些嗜溫梭菌產生的纖維小體只含有單個初級支架蛋白，稱為簡單纖維小體(圖1-b)；而另一些細菌產生的纖維小體含有多個相互作用的支架蛋白，復雜程度較高，稱為高度結構化的纖維小體(圖1-c)。

初級支架蛋白的表達量高，含有多個黏附結構域以及纖維素結合域[8]。例如，在嗜纖維梭菌(Clostridiumcellulovorans)中，酶EngE上的錨定結構域模塊與初級支架蛋白的黏附結構域相互作用形成簡單纖維小體；此外，EngE酶還含有1個肽聚糖結合的Slayer同源(SLH)結構域，可將其錨定到細胞表面[9]。高度結構化的纖維小體包含多個支架和多種酶，其初級支架蛋白含有專門的錨定結構域，通過與錨定支架蛋白的黏附結構域相互作用來介導細胞表面附著。錨定支架蛋白通過專門的錨定模塊與細胞表面相互作用，非共價結合于SLH結構域或共價結合于轉肽酶序列。銜接子支架蛋白存在于更復雜的纖維小體，介導支架蛋白-支架蛋白或支架蛋白-酶的連接，調節纖維小體的組裝[10]。單價銜接子支架蛋白(含單個黏附結構域)可以改變整合到纖維小體中的酶的類型，并且可以根據底物的不同，插入不同活性的酶到不同的纖維小體復合物中；多價銜接子支架蛋白(含有多個黏附結構域)可以作為擴增纖維小體復合物和多個酶整合的平臺，能夠更有效地對底物進行水解[11]。

目前，已知的纖維小體大多數是細胞錨定型的，而在熱纖維梭菌(C.thermocellum)中發現了固有的無支架蛋白的細胞游離型纖維小體，其結構成分與細胞錨定型纖維小體不同[12]。

1.2 酶組分

纖維小體在支架蛋白存在的情況下，通過黏附結構域-錨定結構域相互作用將一系列不同的酶結合起來，使得各種纖維素相關的酶在彼此協調有序的空間里高效地發揮作用。纖維小體中的酶組分與游離纖維素酶系中的相似，都屬于糖苷水解酶家族，各組分之間具有協同作用。

最早發現的熱纖維梭菌纖維小體中含有多種纖維素酶、木聚糖酶、果膠酶和果膠裂解酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、糖酯酶、幾丁質酶和混合連接β-葡聚糖酶，具有高效打破結晶纖維素的結晶結構和降解纖維素鏈的能力[13]。Ravachol等闡明了解纖維梭菌(C.cellulolyticum)中13個GH9家族的外切葡聚糖苷酶的特征，這些酶依據各自獨立化的組織模塊表現出不同的酶活以及與其他外切葡聚糖苷酶多元化的協同效應[14]。上述報道表明，纖維小體中酶的多樣性與協同性對于高效降解纖維素底物的重要性。其他糖苷水解酶(如GH5、GH10、GH11 和GH43等)是纖維小體的常見組件，為細菌提供了1個強大多樣的酶系，增加植物細胞壁多糖的水解。

纖維小體中除了含有錨定結構域的纖維素降解酶外，還存在含有錨定結構域的其他酶蛋白，如絲氨酸蛋白酶抑制劑[15]、蛋白酶[16]和expansin-like蛋白[17]。此類蛋白質對于細菌的生理生化過程、纖維小體組分的裝配以及生物質的降解都有一定的作用。

1.3 黏附結構域-錨定結構域

黏附結構域-錨定結構域之間通過非共價鍵連接，是纖維小體裝配的基礎。這種非共價作用是自然界中最強的蛋白質-蛋白質相互作用之一，并且表現出物種特異性[18]。

目前，在厭氧微生物纖維小體中發現了3種黏附結構域-錨定結構域，分別為typeⅠ、typeⅡ和typeⅢ[19]。typeⅠ相互作用存在于含有錨定結構域的催化亞基和初級支架蛋白的黏附結構域之間；typeⅡ相互作用發生在2個支架蛋白中，通常是錨定支架蛋白和初級支架蛋白之間，但也有例外，例如，溶纖維素擬桿菌(Bacteroidescellulosolvens)是唯一已知的具有相反相互作用模式的細菌，即其酶含有typeⅡ錨定結構域，而scaffoldins包含typeⅠ錨定結構域[20]。typeⅢ 黏附結構域-錨定結構域對在反芻球菌的纖維素酶體中發現，不同于在梭菌屬中觀察到的typeⅠ和typeⅡ[21]。

對黏附結構域和錨定結構域模塊的結構研究表明，其對于界面識別起關鍵作用，負責纖維小體中模塊間的識別和綁定。typeⅠ的黏附結構域通常由約150個氨基酸組成，并且以2個9-鏈β-折疊組成果凍卷的拓撲結構，其中β-折疊上的5、6、3、8鏈與錨定結構域相互作用[22]。typeⅢ黏附結構域存在與 typeⅠ黏附結構域類似的拓撲異構結構，其β-折疊的5、6、3、8鏈與錨定結構域相互作用，而4鏈和8鏈之間包含2個“β轉角”，類似于typeⅡ型的黏附結構域[23]；此外，typeⅢ黏附結構域還有1個典型的13-鏈α螺旋被1個氨基酸末端循環所包圍，在其他類型的黏附結構域中是不存在的[24]。

typeⅠ型的錨定結構域含有約70個氨基酸并折疊成2個串聯重復，每個重復包含1個特異性的Ca2+結合環和1個α-螺旋，在螺旋的10、11、17、18位點處存在保守的特征性“識別殘基”[25]。錨定結構域通常通過2個α螺旋重復序列的其中1個α-螺旋與黏附結構域相連，由此提出了typeⅠ型的雙重結合模式，即2個對稱重復的錨定結構域以任意1個與黏附結構域結合，且能以180°旋轉。這表明含有錨定結構域的蛋白以2個不同的取向摻入復合物中，可以避免大的多組分的纖維素酶體中的空間沖突，促進纖維素底物降解期間酶的構象變化。typeⅡ的黏附結構域-錨定結構域對不具有雙重結合模式，2個螺旋通過黏附結構域-錨定結構域界面處的幾種相互作用與黏附結構域相連，表現出了單一結合模式[26]。模塊之間的結合模式沒有嚴格的界限，typeⅢ型相互作用可以是單一結合模式或雙重結合模式，如瘤胃菌屬typeⅢ的黏附結構域-錨定結構域是高度多樣的，并且在一些情況下，第2個鈣結合性錨定結構域環的序列嚴重失真；生黃瘤胃球菌 (Ruminococcusflavefaciens)的Ctt A蛋白的typeⅢ的錨定結構域含有2個額外的螺旋，以類似typeⅠ型相互作用的方式與Sca E 黏附結構域相連。

1.4 纖維素結合模塊(CBM)

纖維素結合模塊能夠選擇性地將纖維小體錨定在纖維素底物上，在纖維素降解中發揮關鍵作用。幾種梭菌型纖維小體的支架蛋白都包含1個CBM3，位于支架蛋白的 N 端或者序列的中間[27]，例如，解纖維梭菌中的支架蛋白Cip C含有160個氨基酸組成CBM3，這與熱纖梭菌纖維小體支架蛋白的CBM3很相似。

最近的研究發現，纖維小體中還存在CBM2家族的纖維素結合模塊，如，纖維放線菌(Acidothermuscellulolyticus)纖維小體細胞游離型的支架蛋白Sca M中含有3個typeⅠ型的黏附結構域和2個CBM2家族；C.clariflavum的基因組中也發現了類似的編碼含CBM2的支架蛋白基因[28]。CBM2通常與游離的纖維小體相關，被分為2個亞家族，其中一個結合纖維素，而另一個結合木聚糖[29]。CBM2僅存在于游離型的支架蛋白上而不存在于細胞錨定的支架蛋白上，這表明其與CBM3有著不同的作用。

CBMs對纖維小體的功能有十分重要的影響，但并非僅作為支架蛋白的一部分。已知的纖維小體的纖維素結合蛋白僅含有CBM2和CBM3 2個家族，但在纖維小體的酶組分中CBM家族廣泛分布，其中CBM3、CBM6、CBM50家族的CBM占的數量較多，這些結構與酶的催化作用密切相關[30]。

1.5 細胞表面結合模塊

纖維小體通過其支架蛋白上的細胞結合模塊與細菌細胞表面的肽聚糖共價相連，將其緊密地結合于細胞表面，且不同纖維小體的連接方式具有多樣性[31]。目前，對纖維小體附著于細胞表面的機制研究得比較少，但它對于纖維小體發揮生物學功能有重要的影響。

支架蛋白中最常見的細胞表面結合模塊是表層同源結構域(S-layer homology module，SLH)，如熱纖維梭菌纖維小體的多個支架蛋白均帶有C端SLH 模塊，SLH 模塊將這些支架蛋白錨定在細胞表面上[32]。在解纖維梭菌的纖維小體中，SLH 模塊存在于纖維小體的酶組分 EngE中，支架蛋白中則含有4個親水性結構域(HLD)，二者共同作用將纖維小體錨定于細胞表面[33]。此外，在瘤胃球菌的纖維小體中，其支架蛋白1個類似LPXTG 的基序(motif)，通過溶蛋白性裂解和分選酶(sortase)-介導的附著機制共價結合在細胞表面[34]。

1.6 纖維小體表達調控

纖維小體在底物碳源的降解方面發揮著重要功能，同時，碳源也是決定纖維小體組裝的重要因素，影響著酶亞單元的整合以及整體結構。定量蛋白組學分析顯示，熱纖維梭菌中纖維小體的催化亞基的分布受底物依賴性的調節，纖維小體及其他一些碳水化合物活性酶(CAZymes)基因的表達在纖維素發酵期間上調現象[35]。其纖維小體的結構組分包括支架蛋白CipA(Cthe3077)和7種錨定蛋白，含有Ⅱ型黏附結構域的錨定蛋白有5種(Cthe1307/SdbA、Cth3078/OlpB、Cthe3079/Orf2p、Cthe0735、Cthe0717)，其余2種含有Ⅰ型黏附結構域(Cthe3080/OlpA、Cthe0452)，其中編碼CipA、Orf2p、OlpB和OlpA的基因在纖維素發酵過程中表現出最大量的表達。在底物缺乏的情況下，跨膜 anti-σ因子與細胞中的σ因子相連，每種anti-σ因子也有1個類似CBM的組件，與外部培養基中多糖底物相結合。CBM與相應的底物相結合導致 anti-σ因子改變構象，釋放輔助性σ因子，然后與RNA聚合酶相互作用，從而啟動纖維小體基因的轉錄[36]。

2 纖維小體的功能

2.1 纖維小體對植物細胞壁的降解

研究表明，纖維小體能夠在各種各樣的環境中高效地降解植物細胞壁。瘤胃是食草類動物提供能量的主要場所，包含1個由古細菌、原生動物、真菌和細菌等組成的復雜群落，參與植物細胞壁結構多糖的降解。瘤胃是迄今已知的纖維素降解能力最強的天然發酵罐，但實際上瘤胃中真正降解纖維素的微生物種類和數量都相對較少[37]。這些微生物中降解植物細胞壁的酶，多以纖維小體多酶復合體的形式黏附于細胞表面，緊密結合纖維素，由此降解架構復雜且不溶性的大分子多糖底物。目前，瘤胃中唯一已知的產纖維小體的細菌是瘤胃球菌，其多酶復合物的組裝依靠內部的黏附結構域-錨定結構域相互作用，通過其CBM模塊促進底物靶向和細菌黏附，從而引發纖維素底物的解構。

此外，在C.clarilavum纖維小體的基因組中，編碼含錨定結構域蛋白的基因含有2個擴展樣蛋白基因Clocl_1862和Clocl_1298，是首例在細菌中發現的擴展樣蛋白[17]。擴展蛋白是一類非催化活性的小分子蛋白，它們能夠干擾植物細胞壁多糖的非共價結合，通過機械作用分離相關多糖鏈，從而松散底物的結晶度并破壞植物的細胞壁[38]。Kim等研究發現，利用大腸桿菌宿主異源表達植物擴展蛋白的表達量非常低，然而，細菌源的擴展蛋白具有高的表達量，使其在生物質降解和應用方面存在巨大的優勢[39]。

2.2 纖維小體參與細胞代謝

Bensoussan等對牛瘤胃纖維小體的研究發現，含有錨定結構域的491個蛋白擁有79種不同的功能：12種功能與碳水化合物活性酶相關，參與纖維素的降解；剩余56種與木質纖維素的降解并不相關，其中部分與蛋白質的分解代謝相關，在大分子的降解和清除中發揮著廣泛的作用。在這種情況下，纖維小體中的酶組分與經典纖維素酶功能不同，其中大部分在蛋白質的分解代謝以及微生物相互作用中發揮功能，例如含有錨定結構域的D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶。D-丙氨酰-D-丙氨酸肽是細菌細胞壁的重要結構組分，通常是各種抗生素的靶標位點，是纖維小體參與瘤胃抵御微生物攻擊的一個途徑[40]。這些發現意味著含錨定結構域的蛋白不僅參與纖維素的降解，還廣泛地參與細胞生命活動過程。

3 纖維小體的人工改造及其應用

3.1 微型人造纖維小體

隨著對纖維小體研究的深入，人們已經意識到纖維小體在纖維素轉化中的價值，從而開啟了通過人工設計并改造天然纖維小體，使其更有效地作用于纖維素降解的新思路。人造纖維小體概念由Bayer等首次提出，即通過人工設計并利用基因工程手段改造天然纖維小體，進而高效降解木質纖維素。現已有多個實驗室采用DNA重組技術，構建攜帶黏附域的支架蛋白基因和攜帶錨定域的纖維素酶基因，表達純化后在體外組裝成預期的多酶復合體。

Fierobe等設計了一系列含有2種黏附域的支架蛋白，在體外組裝了含2種纖維素酶的雙酶復合體，它的比活性比游離酶高了7倍[41]。為拓寬纖維小體酶的多樣性，增加對底物的降解，除利用來源于自然界多酶復合體中的纖維素酶外，還可通過基因工程方法將游離纖維素酶或非纖維素酶(β-葡糖苷酶、裂解多糖單加氧酶LPMO和植物細胞壁擴展蛋白)摻入到人工設計的纖維小體中，例如，漆酶的整合提高了纖維素酶活性，從而為人造纖維小體介導的木質素和纖維素的降解鋪平了道路[42]。

人工構建的纖維小體能夠靈活地組合不同的纖維素酶和其他酶組分，能使酶的降解效率成倍地增加，對纖維素的工業化利用十分有利。此外，人造纖維小體啟發了其他復合物的設計，包括自組裝12酶和18酶復合物等，增加了在單個復合物中酶的數量和多樣性，可以設計出更多符合人們意愿的多酶復合體。

3.2 纖維小體用于生物質開發利用

微型人造纖維小體可高效降解植物細胞壁多糖中難降解的纖維素類物質，在發酵生產可再生能源過程中起著極其重要的作用，也為解決纖維素資源利用問題提供了思路。嗜熱纖維小體因其能提高反應速率，增加工藝靈活性，降低污染風險等，在工業應用領域具有極大的潛力。Mora?s等將來源于熱纖維梭菌的熱穩定性外切葡聚糖酶Cel48S、內切葡聚糖酶Cel8A以及通過易錯PCR法獲得的熱穩定的β-葡糖苷酶，引入到人工纖維小體，結果顯示，“熱穩定的”人工纖維小體的降解速率比常規設計的人工纖維小體增加了1.7倍。工程化的嗜熱菌劑完全降解生物質須要引入更多的酶，而將植物生物質轉化為生物燃料的理想嗜熱微生物尚未確定，故開發嗜熱統合生物工藝(consolidated bio-processing，CBP)，將產纖維小體的嗜熱微生物用于生產生物燃料是一個優選的策略[43]。

CBP技術的提出，促使纖維小體作用于植物源的生物質生產生物燃料的發展。該技術是將纖維素酶和半纖維素酶的生成、纖維素和半纖維素多糖成分的水解以及發酵生成生物燃料等一系列生物催化過程組合在一起，是由1種或1組微生物完成的生產工藝[44]。現已將畢赤酵母(Pichiapastoris)[45]、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)[46]和 植物乳桿菌(Lactobacilluslantarum)[47]等幾種微生物工程化，在其細胞表面錨定微纖維小體或人工纖維小體，用于將纖維素酶促轉化成糖和乳酸。上述研究表明，纖維小體組分可以在外來生物體中進行功能性組裝，用于從有機廢物中高效的生產生物燃料。

4 總結與展望

纖維小體能夠高效降解植物細胞壁，在發酵生產可再生能源過程中起著極其重要的作用，也為解決纖維素資源利用問題提供了思路。對纖維小體的研究具有重要的實踐意義和廣闊的應用前景。目前，纖維小體的研究主要集中于基因及基因組水平，尋找纖維小體產生菌以及相關蛋白的表達方面，對纖維小體超分子結構與功能的研究相對缺乏。未來的研究應該致力于纖維小體超分子功能，探索其酶組分如何協同高效降解天然纖維素，以及它們在生態系統中發揮的作用。同時，應繼續深入了解不同來源的纖維小體在組成上的同源性和多樣性、纖維小體分泌和組裝過程等，為工程改造纖維小體和利用纖維素資源提供更多的理論基礎。