稽留流產患者絨毛及蛻膜組織中TLR4、NF-κB的表達及意義

楊秀蓮

廣東省惠州市第三人民醫院婦產科，廣東惠州 516000

稽留流產是妊娠20周內胚胎或胎兒已死亡而未排出母體[1]。發生原因多種多樣，包括遺傳、感染、環境、免疫等因素[2-3],但具體機制不詳。一些研究越來越重視感染及細胞凋亡因素，其可能是導致流產發生的重要因素。多項研究也證實了Toll樣受體4（TLR4）、核轉錄因子-kappaB（NF-κB）與感染及細胞凋亡密切相關。TLR4、NF-κB通過各種機制參與自然流產的發生及發展，但兩者與稽留流產的相關研究甚少。本研究采用免疫組化法檢測TLR4、NF-κB稽留流產患者絨毛及蛻膜組織中的表達，探討兩者與稽留流產的關系，為進一步探討稽留流產的發病機制提供理論基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年1月～2017年10月在惠州市第三人民醫院婦科收治的90例稽留流產患者作為實驗組，其中50例稽留流產伴感染者作為A組，40例稽留流產伴不伴感染者作為B組。A組年齡20～35歲，平均（26.3±2.4）歲；孕齡 7～12 周，平均（9.5±1.5）周；B組年齡 20～36 歲，平均（26.3±2.5）歲；孕齡 7～13 周，平均（9.6±1.5）周。選取同期無合并癥并要求行人工流產的50例早孕婦女作為對照組（C組），年齡23～35歲，平均（27.1±2.5）歲；孕齡 6～10 周，平均（7.5±1.5）周。三組的一般資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。各組夫妻雙方染色體核型正常，男方精液正常，實驗組既往無自然流產、死胎、死產史，無免疫系統異常，無產道異常及遺傳病史，平素月經周期規律，在流產前無用藥史。本研究經醫院醫學倫理委員會批準，參與研究者均簽署知情同意書。稽留流產診斷標準以人民衛生出版社第8版《婦產科學》為主。

1.2 方法

1.2.1 標本來源 所有病例經負壓吸引術后取其絨毛及蛻膜組織，用0.9%生活鹽水沖洗干凈，用4%多聚甲醛固定后送病理科常規包埋石蠟切片。

1.2.2 免疫組織化學 SP法檢測使用的兔抗人TLR4抗體、鼠抗人NF-κB抗體及通用型免疫組化試劑盒均購于北京中杉生物科技公司。按照試劑說明書進行操作。

1.3 觀察指標與評價標準

1.3.1 HE結果判讀 顯微鏡下觀察絨毛組織無水腫，滋養細胞無明顯增生。

1.3.2 免疫組化染色片的閱讀 以細胞胞膜或胞質中出現棕黃色顆粒，其著色強度高于非特異性背景者為判斷陽性。根據染色深淺及陽性細胞數百分比進行處理。染色深淺評分標準：細胞無顯色或顯色不清為0分，細胞呈淺黃色為1分，細胞呈棕黃色為2分，細胞呈棕褐色為3分；陽性細胞數百分比評分標準：＜10%為 0分，10%～50%為 2分，＞50%～80%為 3分，＞80%為4分。將上述兩項評分相加0～1分定為陰性（-）；2～3 分為陽性（+）；4～5 分為中等陽性（++）；6～7分為強陽性（+++）。

1.4 統計學方法

采用SPSS 17.0統計軟件對數據進行分析,采用χ2檢驗、Fishem確切概率法檢驗及Spearman等級相關分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TLR4、NF-κB在絨毛和蛻膜組織的表達

A、B組及C組的絨毛及蛻膜組織中均可見TLR4、NF-κB表達。其中絨毛組織中TLR4主要表達在細胞滋養細胞及合體滋養細胞細胞的胞質和胞膜中，在蛻膜組織中表達于腺體上皮細胞的胞質和胞膜。NF-κB在絨毛的合體滋養細胞、毛細血管內皮細胞的胞漿中，蛻膜組織主要表達在腺體上皮細胞的胞質中。 A、B組與 C組比較，TLR4、NF-κB在 A、B組的絨毛及蛻膜組織中表達均增高（表1）；與B組比較，TLR4在A組的絨毛及蛻膜組織中表達明顯增高，差異有統計學意義（表2）。

表1 TLR4、NF-κB在三組絨毛組織的表達情況的比較[n（%）]

表2 TLR4在A、B組絨毛組織中表達情況的比較（例）

2.2 相關性分析

經Spearman等級相關分析顯示，A組的TLR4及NF-κB在絨毛及蛻膜組織中表達成正相關（r=0.527，χ2=9.56，P＜0.05）（表3）。

表3 A組的TLR4、NF-κB表達的相關性（例）

3 討論

3.1 TLR4與稽留流產的相關性

TLR4廣泛分布在人體組織中，其與相應的配體結合后，通過各種信號傳導通路激活細胞內級聯反應，促進機體的天然免疫應答以及多種炎性細胞因子的基因表達。低濃度的TNF-α可以維持妊娠正常進行，而高濃度的TNF-α可通過以下機制導致流產發生：①促進前列腺素E的合成，進而興奮子宮平滑肌；②促進胚胎滋養細胞大量凋亡；③激發Thl型免疫反應，排斥胚胎組織。TLR4與流產關系密切，張月蓮等[5]研究顯示，復發性流產的發生與外周血淋巴細胞、絨毛及蛻膜組織中TLR4高表達密切相關,提示對早孕女性進行外周血TLR4的監測,有利于預測流產發生的風險。Friebe等[6]在研究自然流產模型鼠中發現,通過加入某些因素使TLR4的異常表達，激活了TLR4信號轉導通路，導致大量炎性因子釋放，使母胎之間產生了較強的免疫排斥反應，最終導致流產的發生，而阻斷TLR4信號通路，能夠減少胎鼠的丟失，進而減少流產發生。本研究結果顯示，在稽留流產患者及正常早孕女性的絨毛滋養細胞及蛻膜組織中均有TLR4表達，但TLR4在稽留流產組表達強度明顯高于C組，兩者差異有統計學意義（P<0.05）；且稽留流產患者中伴有炎癥細胞較多的絨毛組織中的TLR4表達強度明顯高于C組，提示TLR4與人類胚胎發育關系也較為密切；絨毛及蛻膜組織中TLR4的正常表達維持著正常妊娠過程；某些因素導致妊娠女性胚胎中絨毛及蛻膜組織中的TLR4表達增高，而高濃度的TLR4可能通過上述機制使胚胎滋養細胞發生炎癥反應或細胞凋亡，繼而使胚胎發育停止，導致稽留流產發生。

3.2 NF-κB與稽留流產的相關性

NF-κB在機體多種組織細胞中均有表達，其激活后對細胞增殖、氧化應激、細胞凋亡及炎癥反應等過程中發揮著重要作用。如在感染性疾病和自身免疫性疾病的發病機制中，NF-κB通過參與調節炎癥過程中細胞黏附因子和某些細胞因子的表達可能發揮著重要作用[7]。研究顯示，在妊娠女性子宮內膜及蛻膜組織中均有NF-κB少量表達，低濃度的NF-κB可參與早期胚胎的發育及著床過程，而NF-κB的表達上調可導致妊娠過程不能繼續進行。高濃度的NF-κB參與流產發生的機制如下。①調節環氧合酶-2（COX-2）的合成和釋放，后者誘導前列腺素的產生后興奮子宮平滑肌，誘發子宮收縮；②引起胎盤滋養細胞過度凋亡，加劇母胎之間的排斥反應，間接誘發子宮收縮；③調節TNF-α的合成及釋放：高濃度的TNF-α一方面通過提高體內前列腺素E的合成及激活凝血系統，興奮子宮平滑肌，促使胎盤滋養血管內血栓形成，影響絨毛的正常發育；另一方面激發Thl型免疫反應，排斥胚胎組織導致流產；④調節孕酮的表達水平，使孕酮與不能與相應受體結合，不能抑制子宮收縮，繼而不能繼續維持妊娠[8]。多項研究顯示NF-κB與流產關系密切[9-11]。本研究結果顯示，在稽留流產組及正常早孕組的絨毛合體滋養細胞及蛻膜腺上皮細胞中均有NF-κB表達，但在稽留流產患者絨毛及蛻膜中的表達高于對照組，兩者差異有統計學意義（P<0.05），提示絨毛中正常水平的NF-κB可能參與人類早期胚胎發育及著床過程，維持正常妊娠過程；某些因素導致絨毛中NF-κB表達增高后可能通過上述機制則使滋養細胞發生凋亡，繼而胚胎發育停止，導致稽留流產。

3.3 TLR4-NF-KB信號轉導通路與稽留流產的關系

研究發現，TLR是體內介導炎癥反應重要的模式識別受體，能夠識別多種病原微生物并啟動下游信號通路，通過活化NF-κB來啟動機體炎癥介質的表達及激活局部組織的炎癥反應[12]，故TLR4-NF-κB是與抗炎免疫機制密切相關的一條信號傳導通路。TLR4信號轉導主要通過MyD88依賴性途徑來介導NF-κB及促炎細胞因子的產生而激發下游炎癥反應。在細胞內TLR4與配體結合后募集MyD88，使MyD88與特異的接頭蛋白發生橋接，使TLR4把信號傳到細胞內，通過激活一系列酶促使NF-κB入核后使相關基因發生轉錄及翻譯，炎性因子大量釋放后參與炎癥反應及組織器官的損傷[13]。多項研究顯示TLR4-NF-κB信號轉導通路在哮喘[14]、心肌梗死[15]、糖尿病[16]、肺炎支原體感染[17]、骨關節炎[18]、潰瘍性結腸炎[19]等炎癥性疾病中起著重要作用。炎癥因素也是導致流產發生的原因之一。 白雪等[20]發現 TLR4、NF-κB、p65 在復發性流產的絨毛組織中蛋白和mRNA表達水平有升高，推測TLR4-NF-κB信號傳導通路可能與復發性流產發生密切相關。本研究顯示，在同一稽留流產患者伴有炎癥的絨毛及蛻膜組織中TLR4與NF-κB表達成正相關，故推測在早期妊娠過程中某些因素如激活了TLR4一NF-κB信號轉導通路，導致體內某些炎性因子大量釋放或細胞異常凋亡，導致稽留流產發生。