miR-92在上皮性卵巢癌組織中的表達及臨床意義

胡 萍 彭 蔚 吳名桃 劉 婷

1.江西省萍鄉市人民醫院婦科，江西萍鄉 337000；2.江西省萍鄉市人民醫院超聲科，江西萍鄉 337000

上皮性卵巢癌是女性常見的惡性腫瘤，具有隱匿性，臨床早期診斷缺乏特異性指標和診斷方法，當疾病被確診時大多數患者已經發展為癌癥晚期，導致病死率較高[1]。隨著醫療技術水平的逐步提高，通過對腫瘤標志物水平的診斷和檢測，使上皮性卵巢癌的臨床診斷率顯著提高，但仍然受到一定的限制，因此選擇更加具有特異性的診斷標志物對改善患者預后具有積極意義。近年來，有相關學者認為miRNA可以參與到細胞發育、凋亡、分化以及新陳代謝等多種病理生理過程，并且在腫瘤患者的腫瘤細胞中發現有大量miRNAs存在[2]。為此，本研究對上皮性卵巢癌患者組織中miR-92表達以及在卵巢癌發生及發展過程中所發揮的作用作如下研究分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料

經我院醫學倫理委員會的批準同意下，在我院2007年1 月～2017年12月收治的各期上皮性卵巢癌患者、上皮性卵巢良性腫瘤患者以及因生殖器官（除卵巢外）良性病變而行單側或雙側卵巢切除患者中各隨機選擇300例分別作為卵巢癌組、良性卵巢腫瘤組與正常卵巢組。納入標準：均簽署書面知情同意書；年齡為18～80歲；卵巢癌組研究對象經病理檢查明確患有卵巢癌，臨床分期為Ⅰ～Ⅳ期；良性卵巢腫瘤組為同期于我院確診為卵巢良性腫瘤的患者，且接受單側或雙側手術治療；正常卵巢組為同期于我院因生殖器官（除卵巢外）良性病變而行單側或雙側卵巢切除的患者，未患有卵巢疾病。排除標準：患有卵巢交界性腫瘤者；伴有其他嚴重器質性惡性腫瘤的患者[3]。

1.2 方法

1.2.1 實驗試劑與儀器 人卵巢癌細胞株SKVO3購自于上海拜力生物科技有限公司；正常卵巢組織、上皮性卵巢癌組織以及上皮性卵巢良性腫瘤組織均由萍鄉市人民區醫院病理科所提供；TM2000由美國Invitrogen公司提供；DMEM以及Opti-MEM無血清培養基均由Gibco公司所提供；轉染用的脂質體由Lipofectamine提供；miR-92反義寡核苷酸以及對照核苷酸均由上海吉瑪公司提供；細胞增殖檢測試劑盒由廣州市銳博生物科技有限公司提供；熒光素探針細胞凋亡檢測試劑盒購自美國羅氏公司；實施定量PCR試劑由美國Ap-plied Biosystems提供。

1.2.2 提取樣本總DNA 將保存的組織樣本500 μl置于冰上解凍后，利用預冷的PBS液對標本進行洗滌，共洗滌2次，將樣本放入研缽后加入1 ml Trizol后，進行充分的研磨，提取總RNA。之后對OD280以及OD260的吸光度值進行檢測，并測定RNA的濃度以及質量[4]。

1.2.3 合成cDNA 取0.5 μg吸光度比值為1.8～2.1的RNA進行逆轉錄反應，分別加入焦炭酸二乙酯水以及miR-92逆轉錄引物，總體積保持在13 μl。在25℃條件下，共持續反應5 min，并將其置于冰上2 min，之后加入5×逆轉錄酶緩沖液4 μl，加入RNA酶抑制劑以及逆轉錄酶1 μl，保證20 μl的總體積。之后設定反應條件為40℃，反應時間設置為1 h，并在70℃下反應10 min，得到cDNA產物，并將產物放在-20℃的冰箱中保存[5]。

1.2.4 檢測miR-92水平 配置反應體系，取1 μl cDNA模板，miR-92的特異性前向引物、通用反向引物各 1 μl，2×SYBR Green Master Mix， 最后添加無菌蒸餾水，使總體積達到20 μl。將反應條件設置為95℃，反應時間 5 min，之后在 9、57、72℃下各反應 30 s（循環此操作40次），同時U6作為對照[6]。將每例標本實施復孔檢測，共重復檢測2次，對每個反應管中的熒光信號到達預定閾值時經歷的循環數進行詳細記錄，并作為Ct值，再次對Ct值進行檢測，所取平均值即為樣本的Ct值，同時將U6 snRNA作為內參，對Ct值進行檢測，并對樣本miRNA水平利用2-△Ct法進行計算，其中△Ct=CtmiR-CtU6[7]。

1.3 觀察指標

記錄對比三組組織標本中的miR-92水平，分析miR-92水平與淋巴結轉移、臨床分期以及腫瘤分化程度等病理類型之間的關系。

1.4 統計學方法

采用統計學軟件SPSS 22.0分析數據，計量資料以均數±標準差（±s）表示，采用t檢驗，計數資料以率表示，采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組標本組織中miR-92水平的比較

卵巢癌組的miR-92表達水平為（0.645±0.550），高于良性卵巢腫瘤組的（0.491±0.025），差異有統計學意義（t=4.810，P=0.001）；正常卵巢組的 miR-92 表達水平（0.384±0.016）低于卵巢癌組，差異有統計學意義（t=8.157，P=0.001）；正常卵巢組的miR-92表達水平低于良性卵巢腫瘤組，差異有統計學意義（t=6.439，P=0.001）。

2.2 卵巢癌組患者miR-92表達水平與臨床病理特征的關系分析

臨床分期為Ⅲ+Ⅳ期的miR-92表達水平高于Ⅰ+Ⅱ期，中、高分化水平高于低分化，淋巴結轉移患者的miR-92水平高于未轉移者，差異均有統計學意義（P＜0.05）（表2）。

表2 卵巢癌組患者miR-92表達水平與臨床病理特征的關系分析（±s）

表2 卵巢癌組患者miR-92表達水平與臨床病理特征的關系分析（±s）

臨床資料 例數 miR-92表達水平 t值 P值年齡（歲）＜50≥50臨床分期（期）Ⅰ+ⅡⅢ+Ⅳ組織學類型漿液性其他分化程度低分化中、高分化淋巴結轉移1.2150.225 146 154 0.554±0.035 0.514±0.069 42.1630.001 114 186 0.445±0.046 0.763±0.072 1.5650.119 173 127 0.634±0.058 0.645±0.063 44.6060.001 106 194 0.514±0.034 0.861±0.076 28.2870.001有無89 211 0.678±0.044 0.556±0.029

3 討論

上皮性卵巢癌是較為常見的婦科惡性腫瘤，由于其缺乏特異性的診斷指標，患者病情確診時，多數已經發展至晚期，導致上皮性卵巢癌患者的死亡率較高[8]。雖然近年來醫療技術水平不斷得到提高，通過采用手術以及其他治療方法，可使患者5年生存率得到相應提高，但是仍然處于較低水平，所以選擇特異性的診斷指標，提高臨床診斷準確率對改善患者預后有著重要意義[9-10]。

目前糖鏈抗原是診斷上皮性卵巢癌的常用標志物，但是在臨床應用中發現，此標志物對于診斷上皮性卵巢癌的特異性和敏感性不夠優良，所以選擇新的腫瘤標志物對改善患者預后具有積極意義[11-12]。miRNA是一種內源性非編碼RNA，相關研究顯示，在腫瘤產生和發展過程中，miRNA具有重要的調節作用，通過調控靶基因表達，其對細胞的生長、繁殖以及凋亡造成影響，所以miRNA表達與癌癥的產生、病理分期以及分化轉移存在較大關聯[13-15]。本研究利用實時熒光定量檢測法對三組組織樣本中的miR-92表達水平進行檢測，發現卵巢癌組的miR-92表達水平遠高于正常卵巢組以及良性腫瘤組，提示利用miR-92表達水平能夠良好地對疾病類型實施判斷。通過進一步對miR-92表達水平與臨床病理特征之間的關系進行分析，研究結果提示，臨床分期為Ⅲ+Ⅳ期的miR-92水平高于Ⅰ+Ⅱ期，中、高分化水平高于低分化，淋巴結轉移患者的miR-92水平高于未轉移者，提示miR-92可參與癌細胞的增殖、轉移，并且上皮性卵巢癌患者的miR-92表達水平與淋巴結轉移、臨床分期以及腫瘤分化程度存在較大的關聯性。

綜上所述，miR-92可作為上皮性卵巢癌診斷的輔助指標，可為臨床診療提供重要的參考依據和指導方向。